第十五章：甾体激素类药物的分析

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甾体激素类药物的分析

• 结构与分类
  • 结构
    • 具有环戊烷并多氢菲母核的激素类药物
    • 母核
    • 母体衍生结构
  • 按结构分
    • 肾上腺皮质激素
      • 代表药物
        • 氢化可的松(hydrocortisone)
        • 醋酸地塞米松(dexamethasone acetate)
        • 醋酸去氧皮质酮
        • 地塞米松磷酸钠
        • 醋酸曲安奈德
      • 结构特征
        • A环Δ4-3-酮基，为共轭体系，在波长240nm附近有紫外吸收，部分药物在C1-C2或C6-C7之间有双键，吸收波长红移
        • C17位上为α-醇酮基，具有还原性，特征，用于鉴别、含量测定。多数药物有C17-α-羟基，部分药物α-醇酮基上的醇羟基与酸成酯
        • 部分药物的C6或C9位由卤素取代，呈相应的卤化物反应
        • 部分药物C11位上有羟基或酮基取代
    • 性激素
      • 雄性激素及蛋白同化激素
        • 代表药物
          • 甲睾酮(methyltestosterone)
          • 丙酸睾酮(testosterone propionate)
          • 苯丙酸诺龙(nandrolone phenylpropionate)
        • 结构特点
          • A环Δ4-3-酮基
          • C17位上为羟基，部分药物的羟基被酯化
          • 雄性激素上的母核为19个碳原子，蛋白同化激素在C10位上一般无角甲基，母核只有18个碳原子
      • 孕激素
        • 代表药物
          • 黄体酮(progesterone)
          • 米非司酮(mifepristone)
          • 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)
          • 炔诺酮(norethisterone)
        • 结构特点
          • C17位上有甲酮基或乙炔基，特征性基团
          • C17位上多有羟基，有时成酯
          • A环Δ4-3-酮基，有紫外吸收，苯环、乙炔基加强紫外吸收
          • 米非司酮有叔胺，具有碱性
      • 雌激素
        • 代表药物
          • 雌二醇
          • 炔雌醇
        • 结构特点
          • A环为苯环， C3位上有酚羟基，有的药物C3位上的酚羟基成酯
          • C17位上有羟基，有些药物C17位羟基成酯
          • 有些药物在C17位上有乙炔基，构成19-去甲孕甾烷母核
  • 总结
• 理化性质与鉴别试验
  • 性状特征
    • 性状与溶解度
      • 本类药物位白色至微黄色的粉末或结晶性粉末。除钠盐外，多数在三氯甲烷中微溶至易溶，在甲醇或乙醇中微溶至溶解，在乙醚或植物油中极微溶解至略溶，在水中不溶或几乎不溶
    • 比旋光度
      • 鉴别不同甾体激素药物，检查药物纯杂程度的重要依据
      • 偏振光透过长1dm且每1ml中含有旋光物质1g的溶液，在一定的波长和温度下测得的旋光度
      • 如
        • 醋酸地塞米松：二氧六环中10mg/ml下比旋度+82~88º
        • 炔诺酮：丙酮中10mg/mL下比旋度-37°~-32°
        • 地塞米松磷酸钠：无水乙醇中10mg/mL下比旋度+72~+80°
    • 吸收系数
      • 鉴别
      • 具Δ4-3酮结构药物在240nm附近有最大吸收，如醋酸地塞米松在无水乙醇中240nm （15μg/ml）吸收系数为343~371
      • A环为含酚羟基的苯环，最大吸收波长280nm，如雌激素类
    • 熔点
      • 鉴别，反应纯度
      • 药物
        • 炔雌醇熔点202~208℃
        • 黄体酮熔点128~131℃
        • 丙酸睾酮熔点118~123℃
      • 衍生物
  • 化学鉴别法
    • 与强酸的呈色反应
      • 共性反应
      • 与硫酸的呈色反应应用广泛
        • 反应机制：酮基质子化，形成碳正离子，然后与硫酸氢根作用呈色
        • 操作简便，不同药物形成不同的颜色和荧光而区别，反应灵敏
        • 如：泼尼松、苯甲酸雌二醇
          • P368
        • 具体颜色
          • P367-368
      • 还有部分药物以硫酸-乙醇或硫酸-甲醇作为显色剂
        • 如：醋酸甲羟孕酮、甲睾酮、十一酸睾酮
        • 雌性激素药物也常用与硫酸-乙醇溶液的显色反应进行鉴别、含量测定或作为TLC的显色剂
    • 官能团的反应
      • C17-α-醇酮基——还原性
        • 呈色反应
          • 四氮唑盐
            • 可用于皮质激素的分析，除了用于鉴别，还用于TLC的显色及比色含量测定
        • 沉淀反应
          • 氨制硝酸银（多伦）
          • 碱性酒石酸铜（斐林）
        • 如：地塞米松、泼尼松、去氧皮质酮
          • P368
      • C3–酮基和C20–酮基——与羰基试剂反应
        • • 2,4-二硝基苯肼、硫酸苯肼、异烟肼
          • 异烟肼可选择性作用于C3-酮，被HPLC代替
        • 如：可的松、黄体酮
          • P369
      • C17-甲酮基或活泼亚甲基
        • • 亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛
        • • 黄体酮的专属鉴别反应
            • P369
      • 酚羟基
        • 重氮苯磺酸
        • JP用于苯甲酸雌二醇的鉴别
      • 乙炔基
        • 硝酸银
        • 如：炔雌醇、炔诺酮、炔诺孕酮
          • P369
      • 卤素
        • 氧瓶燃烧法或回流水解法将卤原子转化为无机离子后鉴别
        • 如：地塞米松磷酸钠、曲安奈德、丙酸氯倍他索和醋酸氟轻松
          • P369
      • 酯基
        • 水解生成相应的羧酸，根据羧酸的性质鉴别
          • 醋酸酯类产生醋酸，形成乙酸乙酯，香气
          • 戊酸酯、己酸酯产生戊酸、己酸特臭鉴别
        • 如：醋酸去氧皮质酮
          • P369
  • 紫外-可见分光光度法
    • Δ４-3-酮
      • 240nm
      • C1引入双键，最大吸收波长没有显著改变；C6引入双键，最大吸收波长红移
    • 苯环
      • 280nm
      • A环有酚羟基的雌激素
    • 定性、定量分析的依据，常用鉴别实验方法，可通过核对最大吸收波长、最大吸收波长处的吸光度或某两个波长处的吸光度比值鉴别
    • 如：丙酸倍氯米松
      • P370
  • 红外分光光度法
    • 甾体激素类药物结构复杂，结仇差异小，红外光谱特征性强，鉴别的可靠手段
    • ChP：标准图谱对照法
  • 色谱法
    • 薄层色谱法
      • 制剂分析
        • 需提取分离消除干扰
        • 如：复方炔诺酮片
          • P371
      • 对照品法
      • 简便、快捷、分离效能良好
    • 高效液相色谱法
      • 常用HPLC法做含量测定，故也常用HPLC法鉴别
      • 应用最广
      • 如：可的松、地塞米松、甲睾酮、丙酸睾酮、炔雌醇、炔诺酮、左炔诺孕酮、甲地孕酮、甲羟孕酮
• 特殊杂质检查
  • 有关物质的检查
    • 一般具有相似的甾体母核结构，需用色谱法检查
    • 薄层色谱法
      • 地塞米松磷酸钠中杂质检查
        • 自身稀释对照法
      • 氢化可的松中其他甾体检查
        • 色谱条件
          • 溶剂：CHCl3-MeOH(9:1)
          • 硅胶GF254
          • 展开剂：二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385:60:15:2)
          • 展开后晾干
          • 105℃干燥10min
          • 碱性四氮唑蓝显色
        • 结果
          • 供试品杂质斑点面积之和不得大于对照品主成分斑点面积
      • 炔孕酮、去氧皮质酮
        • P372
    • 高效液相色谱法
      • 甾体激素类药物中广泛应用——主成分自身对照
      • 如：甲睾酮
        • P372
  • 硒的检查
    • 二氨基萘比色法
    • 来源
      • 地塞米松、氟轻松、曲安奈德合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢，硒对人体有毒害
    • 方法
      • 再加入2,3-二氨基萘，测定378nm处A值
  • 溶剂残留
    • GC法
    • 如：地塞米松
      • P373
  • 游离磷酸盐检查
    • 磷钼酸比色法
    • 来源
      • 地塞米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠C21羟基与磷酸酯化，精制过程中残留游离的磷酸盐，贮存中酯键水解产生游离的磷酸盐
    • 检测条件
      • UV，740nm
      • 一定浓度的磷酸二氢钾溶液作为标准磷酸盐对照溶液
    • 如：地塞米松磷酸钠
      • P373
• 含量测定
  • 高效液相色谱法
    • 专属性强，广泛用于原料和制剂的含量测定
    • 多用反相HPLC法，要求被测物与色谱行为相近的其他甾体有关物质分离度符合规定
    • 内标法定量时，甾体激素类药物可互为内标
    • 如：地塞米松磷酸钠、曲安奈德乳膏、复方左炔诺孕酮片
      • P374-375
  • 紫外-可见分光光度法
    • 专属性不强，辅料也有干扰
    • 如：醋酸泼尼松龙片
      • P375
  • 比色法
    • 影响因素多，要求供试品和对照品平行操作 对照品比较法 采用溶剂空白
    • 四氮唑比色法
      • 广泛应用于皮质激素类制剂含量测定
      • 原理
        • C17-α-醇酮基被氧化为20-酮-21醛
        • 样品降解最易发生在C17侧链上，氧化、水解产物不发生四氮唑反应，能选择性测定C17未被氧化或降解的药物的含量
      • 常用四氮唑盐
        • 氯化三苯四氮唑 (TTC)/红四氮唑 (RT)
          • λmax=480~490nm
        • 蓝四氮唑 (BT)
          • λmax=525nm
      • 方法
        • 对照品比较法
      • 例
        • 氢化可的松软膏的含量测定
          • 精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液1ml，摇匀，各再精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃的暗处放置40min～45min，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得
          • 影响因素
            • 溶剂与水分
              • 含水量＞5%→反应速度↓
              • 含水10%→A↓10%
              • 含水30%→几无反应
              • 无水乙醇
              • 醛 → A↑
                • 无醛无水乙醇
            • 碱
              • 反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行，以氢氧化四甲基铵的结果最佳
              • 试剂加入顺序
                • 皮质激素类药物→四氮唑盐→碱试液
            • 空气中氧与光线
              • 反应及其产物
                • 怕光
                  • 避光、快速
                • 氧气影响颜色强度和稳定性
                  • 隔绝空气、快速、充N2
            • 温度与时间
              • t℃↑→反应速度↑→甲噆分解↑→测定含量↓
                • ChP，25℃，40～45′
                • BP，30℃，1h
            • 基团
              • • C11酮反应速度＞C11羟基及C17羟基
                • C21羟基反应速度＞C21酯
                • 21位酯化后反应速度减慢，酯化基团越大反应速度越慢
        • 醋酸地塞米松注射液
          • P376
    • 异烟肼比色法
      • 专属性强
      • 原理
      • 影响因素
        • 反应速度
          • C3=O＞C17=O、C20=O；C11=O不反应
        • 溶剂的选择
          • 异烟肼盐酸盐在甲醇、乙醇中溶解性好，常用
        • 水分、氧气与光线的影响
          • 含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓，要求无水
          • 不挥发溶剂、不吸收水分时→ 氧气与光线无影响
        • 酸、异烟肼的量
          • 盐酸：异烟肼=2:1
            • 酸度↑→异烟肼盐发生沉降
            • 酸度↓→A↓，不灵敏
          • 样品：异烟肼=1:8，有助于反应速度加快
        • 温度
          • t℃↑→ ν↑
    • 柯柏(Kober)反应比色法
      • 雌激素与硫酸-乙醇的显色反应，520nm附近有最大吸收，可用于雌激素类药物含量的灵敏测定
      • 原理
        • 质子化、重排、硫酸氧化形成共轭双键发色团
        • 加少量铁盐可加速呈色反应的速率和提高稳定性，溶蚀加入苯酚可消除反应产生的荧光，并加速红色产物的形成。改进后的Kober反应称为铁-酚试剂法
      • 结果
      • 测定范围
        • 采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮片中的炔雌醇的含量
          • P377
  • 非水溶液滴定法
    • 米非司酮
  • 生物样品中的甾体激素的分析