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第四章：药物的含量测定方法与分析方法验证
人民卫生出版社《药物分析》第四章：药物的含量测定方法与分析方法验证，全重点整理，满满干货！适用于药学专业~
编辑于2022-07-21 10:34:43- 相似推荐
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药物的含量测定方法与分析方法验证
药品含量与制剂规格
原料
原料含量

系指含标示组分的质量百分数（%）
含量限度的表示
除另有规定外，均按所含有效物质（以分子式表示）的重量百分数表示（%），不必加注（g/g）
限度要求
含量限度范围，一般不得少于98.5%
未规定含量上限系指不超过101.0%
上限为100%以上时：药典规定的限度或允许偏差，并非真实含有量
制剂
制剂（标示量%）
药物制剂的标示含量（标示量）
含量限度的表示
一般均按标示量的百分含量计算
限度要求
药物种类、剂型、剂量：含量限度的要求不同
制剂的含量限度范围，大多数均规定为标示量（处方量）的95.0%~105.0%
定量分析方法的分类与特点
定量方法特点
分类
容量分析法
特点
操作简单、快速
比较准确（RSD＜0.2%）
仪器普通易得
方法专属性差
有关计算
滴定度（T）
每ml滴定液（规定浓度）相当于被测物质的量(mg)
例
阿司匹林原料药的含量测定
取本品约0.4g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性） 20ml溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于18.02mg的乙酰水杨酸
滴定度的计算
aA+bB→cC+dD（A为药物分子），则有T=M×a/b×m（m为滴定液的浓度）
例
阿司匹林的酸碱滴定，摩尔比1：1，NaOH滴定液0.1mol/L，则T=180.16×1/1 ×0.1=18.02mg/ml
百分含量的计算
原料药
直接滴定法
剩余滴定法
其中
T——滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数
V——滴定时，供试品消耗滴定液的体积（ml）
V0——滴定时，空白消耗滴定液的体积（ml）
F——浓度校正因子，实际浓度/规定浓度
ms——供试品的质量
例
双相滴定法测定苯甲酸钠含量：取本品0.3220g，加水15ml，乙醚30ml与甲基橙3滴，用0.1062mol/L盐酸滴定，至水层显橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，加乙醚20ml，振摇，继续滴定至持续橙红色，消耗盐酸体积21.05ml。计算样品中苯甲酸钠含量。苯甲酸钠分子量144.1。
司可巴比妥的含量测定：取供试品0.1301g，置碘量瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L)25ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1min，暗处静置15min后，加碘化钾试液10ml，立即密塞摇匀，用0.0999mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。已知：样品消耗硫代硫酸钠滴定液15.05ml，空白消耗25.05ml，每ml溴滴定液（0.05mol/L)相当于13.01mg的司可巴比妥。计算含量
制剂
片剂含量测定结果的计算
例
烟酸片含量测定：取本品10片精密称定为3.5840g，研细，精密称取0.3729g，置100 mL锥形瓶中水浴加热溶解后，放冷。加酚酞指示剂3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1005mol/L)滴定至粉红色消耗25.02 mL。每1mL氢氧化钠滴定液 (0.1mol/L)相当12.31mg的烟酸。求供试品中烟酸的标示百分含量（标示量0.3g/片）
光谱分析法
紫外-可见分光光度法（200nm～760nm）
特点
灵敏度高，可达10^-7g/ml～10^-4g/ml
仪器价格低廉操作简单，易普及，应用广
定量原理
朗伯-比耳定律
仪器校正和检定
波长校正
用汞灯中较强谱线237.38，253.65，275.28，296.73，313.16，334.15，365.02，404.66，425.83，546.07nm与576.96nm
或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正
吸收度的检定
用K2CrO7(60mg)+0.005mol/L硫酸液至1000ml
杂散光检查
对溶剂的要求
测定方法
供试品选择合适溶剂配成合适浓度溶液，要求供试品溶液的A应在0.3 ～ 0.7
定量方法
对照品比较法
吸收系数法
计算分光光度法：VitA的三点校正法
比色法：供试品与某种试剂反应产生颜色
制剂含量的计算
 三角形框出的为浓度计算部分
吸收系数法
例
对乙酰氨基酚的含量测定：精密称取本品40.1mg，置250ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50ml溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10ml，加水至刻度，摇匀。在257nm的波长处测定吸收度为0.570，按C8H9NO2的百分吸收系数为715计算。
标准对照法
例
硫喷妥钠的含量测定：取供试品0.2500g，用水稀释至500ml，精密取1ml用0.4%NaOH溶液定量稀释至100ml，作为供试品溶液；另取硫喷妥对照品用0.4%NaOH溶液配制浓度为5.0µg/ml作为对照品溶液。照分光光度法，在304nm波长处分别测得供试品和对照品的吸收度为0.520和0.545，已知1mg硫喷妥相当于1.091mg的硫喷妥钠，试计算硫喷妥钠的含量
D——稀释倍数
W平均——平均片重
W——供试品质量
B——标示量值
荧光分光光度法
特点
灵敏度高，可达10^-12g/ml～10^-10g/ml
在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用
用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减
灵敏度高，但干扰因素多
制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性
荧光分析仪
有二个单色光器：激发单色光器与发射单色光器
激发光源、样品池和检测器成直角
含量测定
常用的方法为对照品比较法
色谱分析法
特点
高灵敏度，可达10^-15g/ml～10^-12g/ml
高专属性，强分离能力
高效能，可多组分同时定量分析
分类
PC
TLC
柱色谱
GC
HPLC
吸附
分配
离子交换
排阻色谱
高效液相色谱
仪器
色谱柱
概述
色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用方法有关
分类
正相HPLC
极性填充剂，弱极性流动相
反相HPLC
固定相极性小于流动相极性，大多C18、C8柱，甲醇、乙腈、水（缓冲液）作流动相。一般色谱柱使用温度不超过40℃，流动相pH控制在2~8之间
检测器
概述
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置
最常用的检测器有
紫外-可见检测器
二极管阵列检测器
荧光检测器
电化学检测器
蒸发光散射检测器
质谱检测器
要求
对HPLC仪器一般要求色谱柱、流动相按品种项下要求
系统适用性试验
色谱柱的理论板数
分离度
要求＞1.5
重复性
RSD≤2%
拖尾因子
应在0.95~1.05
灵敏度
信噪比10:1（定量限）或3:1（检测限）
制剂含量计算
外标法
As：供试品中待测药物的峰面积
Ar：药物对照品峰面积
内标法
测定方法
外标法
外标标准曲线法
外标一点法
一种浓度对照物对比样品中待测组分含量
要求截距接近0，对照品浓度与待测组分浓度接近
内标法
过程：ms+mi→混匀进样→测Ai和As
例
醋酸氢化可的松的含量采用HPLC法测定：取本品对照品适量，精密称定，加甲醇定量稀释成每ml约含0.35mg的溶液。精密量取该溶液和内标溶液（0.30mg/ml炔诺酮甲醇溶液）各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取10ul注入液相色谱仪，记录色谱图。另取本品适量，同法测定，按内标法计算含量。已知：对照品取样为36.2mg，样品取样为35.5mg，测得对照液中醋酸氢化可的松和内标的峰面积分别为5467824和6125843，样品液中药物和内标的峰面积分别为5221345和6122845，计算本品的含量
药物分析方法的验证
需验证的分析项目
鉴别试验
杂质定量或限度检查
原料或制剂中有效成分含量测定
制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定
溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法
效能指标的属性
基础效能指标
专属性
耐用性
限度效能指标
灵敏度
定性指标：检测限
定量指标：定量限
定量效能指标
准确度
精密度
线性
范围
效能指标
专属性
概述
是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性
鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性
分析项目
鉴别反应
应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应
含量测定和杂质测定
色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用已验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法进行验证
准确度
概述
是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示，取同一浓度的供试品用至少6份样品的测定结果进行评价；或3种浓度每个浓度至少3份供试品进行测定
含量测定方法的准确度
原料药
可用已知纯度对照品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较
容量法回收率可达99.7%～100.3%
制剂
要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD
可得到空白辅料
无法得到全部辅料
具体操作
取高、中、低三个浓度，每个浓度三个样本, 共9个数据来评价，回收率的RSD＜2%
UV和HPLC法，一般回收率要求98%～101%
浓度选择
对于化学药，一般中间浓度加入量与供试品中待测定成分量之比控制在1：1 左右；建议高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1.2 : 1，1 : 1 ，0.8 :1 左右，应报告已知加入量的回收率（％ )
对于中药，一般中间浓度加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1 : 1左右，高、中、低浓度对照品加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1 .5：1，1：1 ，0.5：1 左右，应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率（％)计算值，以及相对标准偏差（RSD%)
数据评价
样品中被测成分的含量水平与回收率可接受限度要求的关系
加样回收率：供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果、回收率
精密度
概述
是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度。一般用相对标准偏差表示
计算方法
RSD=标准偏差/平均值×100%=S/X ×100%
可分为
重复性
相同条件下由一个分析人员测定所得结果的精密度
中间精密度
考察随机变动因素，如不同日期、不同分析人员、不同仪器对精密度的影响
重现性
国家药品质量标准采用的分析方法，应进行重现性试验。在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度
数据评价
样品中被测成分的含量水平与精密度可接受限度要求的关系
检测限
概述
是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标
它无需准确，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可
确定方法
直观法（目视法）
用于非仪器分析方法
用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量
信噪比法
GC和HPLC法
用于能显示基线噪声的方法，一般 S/N 3：1时响应浓度或量
基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法
按照LOD=3.3δ/S公式计算， δ为响应值偏差，S标准曲线斜率
定量限
概述
是指试样中被测物能被定量测定的最低浓度或量，其测定结果应符合准确度和精密度的要求。
确定方法
直观法（目视法）
用已知浓度被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量
信噪比法
用于能显示基线噪声的方法，一般 S/N 10：1时响应浓度或量
基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法
按照LOD=10δ/S公式计算， δ为响应值偏差，S标准曲线斜率
线性
概述
是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度之间呈正比关系的程度
检查方法
应在设计的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释，或分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液进行测定。至少制备5个浓度水平，以测得的响应信号与被测物浓度进行回归，观察是否呈线性
建立回归方程C = aA + b；r ＞ 0.999
b表示的是系统误差，应尽量小，才能对低浓度供试品有合格的回收率
范围
概述
是指达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限度或量的区间
分析项目
原料药和制剂含量测定
范围应为测试浓度的80%～ 120%
制剂含量均匀度检查
范围应为测试浓度的70%～ 130%
溶出度或释放度中的溶出量测定
范围应为限度的±30%，如规定了限度范围，则应为下限的-20%至上限的+20%；杂质测定，范围±20%
耐用性
概述
是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度
典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等
HPLC法变动因素
流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速
GC法变动因素
色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等
药品质量标准分析项目与验证指标的关系
分析目的与验证内容
鉴别、检查和含量测定
鉴别
化学鉴别
通过空白试验阴性反应验证方法专属性；通过改变实验条件验证方法耐用性
仪器分析法鉴别
供试品理化性质与对照品比对
检查
限量检查
一般对照实验，专属性、耐用性、检测限
微量杂质含量测定
除检测限均需验证
含量测定
容量法
取对照品验证方法专属性、三种取样量验证准确度、精密度及改变测定条件验证耐用性
仪器分析方法
除检测限、定量限均需验证
分析样品的制备
分析目的与样品制备
分析目的不同，样品制备方法不同
按分析目的分类
鉴别试验
化学分析法
一般直接溶解、水解或有机破坏后测定
光谱分析法
紫外一般溶解后测定
IR对于多晶型药物或制剂检测时，样品需溶解或纯化
色谱分析法
一般直接配制测定
要求
排除干扰，防止假阳性
杂质与组分或元素的检查
杂质检查一般无需特殊处理
药物中特征元素检查一般需化学分解或有机破坏
主成分的定量测定
原料药含量测定
常用容量检查法一般直接溶解测定；卤素有机破坏后测定
制剂含量测定
多数色谱法，溶解后测定，少数蒸汽压不足需气相衍生化
制剂溶出量测定
通常溶出液快速过滤后UV测定
药物稳定性试验
为保证方法专属性样品制备较为复杂，包括将样品热分解、酸分解、碱分解、氧化分解及光分解后进行测定
样品基质与样品制备
基质不同，样品制备方法不同
按样品基质分
化学原料药
一般纯度高无需制备
药物制剂
辅料的干扰、基质的干扰，因此需过滤或提纯
生物样品
浓度低、干扰大，需较复杂前处理
样品制备的常用方法
直接溶解法
特点
适用于具有特征基团的药物及其简单制剂
方法
溶剂溶解
试样直接溶解于适当的溶剂
固体分散
试样分散于固体或液体稀释剂
应用
化学药物的鉴别、检查、含量测定
提取分离法
特点
适用于基质复杂（干扰严重）样品分析
方法
用水或与水混溶的极性有机溶剂将被测物质与试样基质分离
包括溶剂提取法、超声处理法、加热回流法、索氏提取、冷浸或渗漉法等
应用
适用于糖浆剂, 软膏剂, 栓剂等药物制剂或中药材及其简单制剂鉴别与含量测定
萃取浓集法
特点
适用于复杂基质中微量或痕量组分含量测定
方法
用与水不互溶的有机溶剂萃取组分
溶剂萃取
固相萃取
应用
中药及其制剂或生物样品中组分的定量分析
化学分解法
特点
适用于含潜在特征基团或特征元素有机药物的分析
方法
回流水解, 使结合元素转化为无机态
酸/碱回流水解
方法原理（卤素）
将含卤素的有机药物溶于适当溶剂中，加氢氧化钠或硝酸银溶液加热回流使其水解，将有机结合的卤素，经水解作用转变为无机卤素离子，然后采用间接银量法测定
间接银量法
定量加入过量的AgNO3，过量的硝酸银以硫氰酸铵为滴定剂，硫酸铁铵为指示剂滴定
氯离子使用间接银量法，溴离子和碘离子常用直接银量法
适用范围
烷烃结构的卤素，对于连在芳香基团上的卤素检测有困难
例
三氯叔丁醇的测定
锌粉还原法
方法原理
在氢氧化钠和锌粉存在的条件下，有机药物（多用于含碘有机药物）加热回流，发生还原裂解反应，使有机结合的卤素（碘）转变为无机卤素离子（碘离子），继而采用间接银量法或其他方法进行测定
适用范围
碘原子与苯环直接相连的药物
例
泛影酸的测定
取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的泛影酸
应用
含金属或卤素（易分解）有机药物的含量测定
有机破坏法
特点
适用于金属元素或卤素等特征元素分析
方法
基于高温，使有机结合元素转化为无机状态
酸破坏法(湿法)
硫酸为基础消解剂
碱破坏法(干法)
无机碱或盐为辅助消解剂
氧瓶燃烧法
氧气为助燃剂(辅助消解剂)
应用
有机结合牢固的金属, 卤素, 氮, 硫, 磷等元素的定量测定
具体应用
凯氏定氮法：含氮有机药物定量分析方法
原理
常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量
氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后用标准无机酸滴定，最后根据所用标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量
凯氏消解装置
凯氏消解瓶
分解剂(消解剂)
硫酸
辅助剂
硫酸铜——催化消解反应
硫酸钾——提高消解剂沸点
供试品
常量法——含氮25~30mg
半微量法——含氮1.0~2.0mg
半微量凯氏定氮蒸馏装置
水蒸气发生器(A)
缓冲瓶(B)
蒸馏器(C)
加样漏斗(D)
冷凝管(E)
接收瓶(F，含接收液)
阀门(G,H)
测定法
消解
溶液成澄明的绿色, 继续加热30min

蒸馏
40%氢氧化钠碱化, 水蒸气蒸馏
吸收
2%硼酸溶液
滴定
硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定
甲基红-溴甲酚绿做指示剂(灰紫色)
适用范围
中国药典用本法测定含有氨基或酰胺结构的药物含量。对于以偶氮或肼等结构存在的含氮药物，因在消解过程中易于生成氮气而损失，须在消解前加锌粉还原后再依法处理；而杂环中的氮因不易断键而难以消解，可用氢碘酸或红磷还原为氢化杂环后再行消解。对于含氮量较高的样品（超过10%），可在消解液中加入少量多碳化合物，如蔗糖、淀粉等作为还原剂，以利于氮转变为氨
例
氨基酸氮含量的测定
高温炽灼法
操作方法
将有机物灼烧灰化以达分解的目的。将适量样品置于瓷坩埚或铂坩埚中，加入无水碳酸钠、氢氧化钙或轻质氧化镁等以助灰化，混匀后，先小火加热使样品完全炭化，然后高温灼烧，使其完全灰化
适用范围
适用于湿法不易破坏完全的药物以及不能用硫酸进行破坏的有机药物
氧瓶燃烧法
操作方法
系指将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别，检查或含量测定
原理
装置
氧瓶：硬质玻璃(石英玻璃)
规格
10~20mg——500mL
100~200mg——1000~2000mL
塞子下有铂丝用于放置样品：φ1mm；2/3瓶高
无灰滤纸；氧气；吸收液
无灰滤纸规格及折叠方法
实验操作
吸收液选择原则