第二章：药物的鉴别试验

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药物的鉴别试验

• 药物鉴别试验的定义与目的
  • 定义
    • 根据药物的分子结构、理化性质，采用物理、化学、物理化学或生物学方法，判断（鉴别）药物的真伪
    • 药物：化学结构已知的原料药或制剂
  • 目的
    • 用来证实贮藏在有标签的容器中的药物是否为其所标示的药物
    • 鉴别项下规定的试验方法，仅反映该药物某些物理、化学或生物学等性质的特征，不完全代表对该药物化学结构的确证
• 鉴别试验的项目
  • 性状（description）
    • 外观
      • 聚集状态、晶型、嗅味
    • 溶解度
      • 是药品的一种物理性质，是指药品在溶剂中的溶解能力
      • 药典中的溶解度是指在各品种项下选用的溶剂中的溶解性能（原料药）
      • 溶解度不合格提示了其中一个或几个相关杂质影响其表观溶解行为，也可能是晶型或粒度不合格
    • 物理常数
      • 熔点
        • 由固体熔化成液体的温度、熔融同时分解的温度或在融化时自初熔至全熔的一段温度
        • 熔点难以判断或熔融同时分解的样品应同时采用热分析法测定
      • 比旋度
        • 反映手性药物特征及其纯度的主要指标，可区别药品、检查纯度、测定制剂含量。一定波长与温度下，偏振光透过长1dm且每1mL中含有旋光型物质1g的溶液时测得的旋光度称为比旋度
        • 手性药物的重要特性，既可真伪鉴别、纯度检查，又可含量测定
          • 
      • 吸收系数
        • 给定波长、温度、溶剂，单位浓度、单位液层厚度下药品的吸光度
        • 中国药典---百分吸收系数，E既可以考察原料质量，亦可作为含量测定的依据
          • 
  • 一般鉴别试验（General identification test)
    • 定义
      • 依据某一类药物的化学结构或理化性质的特征，通过化学反应来鉴别药物的真伪
    • 概述
      • 通过一般鉴别试验只能证实是某一类药物，而不能证实是哪一种药物。例如：钠盐的焰色试验，不能辨认是氯化钠、苯钾酸钠或者是其它某一种钠盐药物。 一般只适用于纯品
      • 通常在一般鉴别试验的基础上，再进行专属鉴别试验。
      • 依据同类药物的结构、性质进行的真伪鉴别
        • 无机药物：其阴、阳离子的特殊反应
        • 有机药物：共有母核、官能团特征反应
      • 特点：确定(区分)类别，不能够确定个别品种
    • 常用有机一般鉴别试验
      • 有机氟化物-氧瓶燃烧后茜素氟蓝、硝酸亚铈反应显蓝紫色
        • 样品经氧瓶燃烧法破坏，被碱性溶液吸收成为无机氟化物，与茜素氟蓝、硝酸亚铈在pH4.3溶液中形成蓝紫色络合物
          • 
      • 水杨酸盐-弱酸性下与三氯化铁反应显紫色
        • 本品在中性或弱酸性条件下，与三氯化铁试液生成配位化合物，在中性时呈红色，弱酸性时呈紫色
          • 
      • 酒石酸盐-中性溶液加氨制硝酸银产生银镜
      • 芳香第一胺类-芳伯胺酸性下加亚硝酸钠与β -萘酚产生橙红色沉淀
      • 苯甲酸盐-中性下与三氯化铁反应褐色沉淀
      • 托烷生物碱-莨菪酸结构加发烟硝酸黄色，冷后加氢氧化钾醇溶液显紫色
  • 专属鉴别试验（Specific identification test）
    • 证实某一种药物的依据
    • 根据每一种药物化学结构的差异及其引起的物理化学性质不同，选用某些灵敏的定性反应，来鉴别药物真伪。以区别同类药物或具有相同化学结构部分的各个药物单体
    • 鉴别方法选择原则
      • 专属、灵敏、简便、快速
      • 尽可能采用药典已有方法
      • 不同类型方法结合，2-4种
      • 原料侧重光谱方法；制剂侧重色谱法
• 鉴别方法
  • 鉴别方法选择
    • 常用方法
      • 化学法，光谱法，色谱法和生物学法
    • 中药材鉴别方法
      • 还有显微鉴别法和特征图谱或指纹图谱鉴别法
    • 制剂的鉴别
      • 尽可能与原料药相同；必须排除辅料干扰；多组分或微量成分，须用更灵敏、专属的方法
    • 特殊性质
      • 采用特定方法。如手性、晶型等
  • 鉴别方法分类
    • 化学鉴别法
      • 呈色反应鉴别法
        • 定义
          • 供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下进行反应，生成易于观测的有色产物
        • 分类
          • 三氯化铁呈色反应：用于含酚羟基药物
          • 异羟肟酸铁反应：多用于芳酸及其酯类、酰胺类
          • 茚三酮呈色反应：用于氨基醇或氨基酸结构药物
          • 重氮化-偶合显色反应：用于芳伯氨基药物
      • 沉淀生成反应鉴别法
        • 与重金属离子的沉淀反应
        • 与生物碱沉淀剂的沉淀反应-多用于生物碱及其盐，遇碘化铋钾产生橙红色沉淀
        • 丙二酰脲类的硝酸银反应-如巴比妥
      • 荧光反应鉴别法
        • 药物溶液加硫酸后，在可见光下发射荧光
        • 药物和某些试剂反应后，于可见光下发射出荧光
      • 气体生成反应鉴别法
        • 大多数的胺（铵）类药物、酰脲类药物以及某些酰胺类药物，可经强碱处理后，加热，产生氨（胺）气
        • 化学结构中含硫的药物，可经强酸处理后，加热，发生硫化氢气体
        • 含碘有机药物，经直火加热，可生成紫色碘蒸气
        • 含醋酸酯和乙酰胺类药物，经硫酸水解后，加乙醇可产生醋酸乙酯的香味
      • 使试剂褪色的鉴别法
        • 维生素C的二氯靛酚反应
        • 司可巴比妥钠的碘试液反应
      • 测定生成物的熔点
        • 繁琐，较少用
    • 光谱鉴别法
      • 紫外光谱鉴别法
        • 分类
          • 
          • 测定最大吸收波长,或同时测定最小吸收波长
          • 规定一定浓度供试品在最大吸收波长处的吸收度
          • 规定吸收波长和吸收系数法
          • 规定吸收波长和吸收比值法
          • 经化学处理后,测定其反应产物的吸收光谱特性
        • 应用举例
          • 
      • 红外光谱法
        • 概述
          • 分子吸收某些波长的红外线，而引起分子振动能级和转动能级的跃迁所得到的吸收光谱
          • 红外法专属性强，特别适用于组分单一、结构明确的原料药，各国药典中绝大多数原料药均采用此法进行鉴别
          • 中国药典采用标准图谱对照法、对照品法
        • 试样制备的方法
          • 固体—压片法（溴化钾）；糊法
          • 液体—膜法；溶液法
          • 气体—气体吸收法
          • 测定前应录制聚苯乙烯薄膜光谱图，并与标准谱图对照，以检查仪器性能
        • 原料
          • 注意晶型，可对照品比较或溶液法测定
        • 制备鉴别
          • 要求
            • 一般提取分离，适当干燥后再压片绘制图谱
            • 注意溶剂选择，防止晶型转变
          • 具体情况
            • 辅料无干扰：标准谱图
            • 辅料无干扰，晶型转变：对照品比对
            • 晶型不变，辅料干扰：指纹区选择3~5个辅料无干扰的待测成分的特征吸峰作鉴定
            • 晶型变化、辅料干扰：不宜用IR法
          • 常用方法
            • 直接用有机溶剂提取主成分，去除辅料干扰后作红外图谱与对照图谱比较
            • 对于有机酸的碱盐或有机碱的酸盐，可以相应加酸或碱使有机酸/碱游离沉淀，取沉淀干燥或用有机溶剂提取有机酸/碱并干燥后制作红外图谱与对照图谱比较
            • 主成分为有机酸的品种，可先加碱使主成分溶解，再加过量的酸使主成分游离并沉淀，干燥后作红外图谱与对照图谱比较
            • 对未加辅料或辅料干扰较小的制剂，可直接作红外图谱与对照图谱比较
        • 注意事项
          • 压片法影响因素较多，注意制备条件对图谱形状及各谱带相对吸收强度的影响；若样品与KBr间有离子交换，改用KCl
          • 供试品制备时研磨程度差异或吸水程度不同等原因，均会影响光谱形状，注意二氧化碳和水汽的干扰
          • 仪器间分辨率差异及不同操作条件的影响，采用聚苯乙烯薄膜光谱图进行仪器校正
          • 对于存在多晶现象且无可重复转晶方法的药物不适用
          • 对照图谱指所有的《药品红外光谱集》，以后卷为准
      • 近红外光谱法
        • 定义
          • 被测物质在近红外谱区750~2500nm（12800~4000cm-1）的特征光谱并利用适宜的化学计量学方法提取相关信息后，对被测物质进行定性、定量分析的一种分析技术
        • 具体的分析过程主要包括以下几个步骤
          • 选择有代表性的样品并测量其近红外光谱图
          • 将测量的光谱和基础数据，用适当的化学计量方法建立校正模型
          • 未知样品组分或性质的测定
        • 优点
          • 快速、无需前处理、不破坏样品
          • 对于经常的质量监控是十分经济且快速的，但对于偶然做一两次的分析或分散性样品的分析则不太适用。因为建立近红外光谱方法之前必须投入一定的人力、物力和财力才能得到一个准确的校正模型。
        • 多用于生产线上制剂或中药材真伪鉴别
      • 原子吸收法
        • 利用金属原子蒸气可以吸收特征谱线的特性，根据供试溶液在特征谱线处的最大吸收和特征谱线的强度减弱进行定性、定量
      • 核磁共振
        • 通过测定基团上质子峰的化学位移和偶合常数进行药物的鉴别
      • 质谱法
        • 将被测物质离子化后，在高真空状态下按离子的质核比大小分离，而实现物质成分和结构分析的方法
      • X射线粉末衍射法
        • 化合物的晶型-特定X射线衍射图，衍射极大点间的距离及其相对强度可用以进行结晶物质的定性或定量分析
        • 比较供试品与对照药物的粉末X射线衍射图来完成
      • 晶型分析
        • 药物的多晶型现象极为普遍，晶型不同，它们的物理性质如密度、熔点、硬度、外观、溶解度和溶出速度等方面均有显著性差异，从而影响药物稳定性、生物利用度、毒副反应等
        • 鉴别晶型主要是依据不同晶型具有不同的理化特性及光谱学特征，采用熔点法、热分析法、红外分光光度法及X-射线衍射法等进行鉴别。
    • 色谱鉴别法
      • 适用于复杂环境下药物有效成分及杂质的鉴别，具有分离、分析同时进行的特点
      • 薄层色谱鉴别法
        • 薄层色谱系统适用性试验
          • 分离效能（清晰分离的斑点）
          • 检测灵敏度（显清晰斑点）
          • 比移值（0.2~0.8之间）
        • 方法
          • 
          • 相同浓度的供试品与对照品比较，主斑点：应一致
          • 供试品溶液与对照品溶液等体积混合，供试品与混合液主斑点：应一致
          • 结构相似的其它药物与供试品溶液的主斑点比较：应区分
          • 上一项下两种溶液等体积混合，应显示两个清晰分离的斑点：应区分
        • 薄层色谱法是《中国药典》应用于中药尤其是中成药的主要鉴别方法。《中国药典》正文因受体例的限制，对于中药薄层色谱仅限于文字描述，配套出版的薄层色谱彩色图集用于补充更准确的信息，有助于检验人员准确理解、有效执行药典标准
      • HPLC、GC鉴别法
        • 供试品和对照品色谱峰保留时间一致
        • 供试品和对照品药物峰的保留时间与内标物峰的保留时间的比值一致
      • 纸色谱鉴别法
    • 显微鉴别法
      • 适用于中药材及其制剂的鉴别，通常采用显微镜对药材的（饮片）切片、粉末、解离组织或表面制片，以及含饮片粉末的制剂中饮片的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别的一种方法
      • 选择有代表性的供试品
    • 生物学法
      • 利用微生物或实验动物进行鉴别的方法。
      • 生物学法往往用于效价测定的同时用于定性鉴别如卵泡刺激素、缩宫素等
    • 指纹图谱与特征图谱鉴别法
      • 概述
        • 通过对所得到的能体现中药整体特性的图谱识别，提供一种能够比较全面的控制中药质量的方法，从化学物质基础的角度保证中药制剂的稳定和可靠
        • 采用指纹图谱模式，将中药内在物质特性转化为常规数据信息，用于中药鉴别和质量评价
      • 定义
        • 生药经过适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够标示该生药特性的共有峰的图谱
      • 二者区别
        • 特征图谱是中药主要有效成分的特征峰谱图，指纹图谱包含更多内容，更加具有专一性
          • 通过主要特征峰的含量或比例，有效地控制样品的质量，确保质量相对稳定
          • 通过中药指纹图谱的特异性，有效地鉴别样品的真伪或产地
      • 特性
        • 系统性
          • 包含主要成分或指标成分
        • 特征性
          • 高度选择性，能区分真伪与优劣
        • 重现性
          • 误差应在允许的范围内
      • 常用方法
        • 色谱、质谱、核磁、X-射线衍射
• 鉴别试验的条件
  • 溶液的浓度
    • 主要指被鉴别药物的浓度，加入的各种试剂一般是过量的
  • 溶液的温度
  • 溶液的酸碱度
    • 大多鉴别试验需要一定的酸碱性条件
  • 试验时间
• 鉴别方法的验证
  • 专属性
    • 其他成分存在的情况下，采用的鉴别方法能否准确鉴别出被测物质的特性
  • 耐用性
    • 测定条件发生小的变动时，测定结果受到的影响程度。如果有变动需限定相应的条件
  • 灵敏度