石墨烯TiO2

石墨烯（Graphene）是一种以sp²杂化连接的碳原子紧密堆积成单层二维蜂窝状晶格结构的新材料 [1] 。石墨烯具有优异的光学、电学、力学特性，在材料学、微纳加工、能源、生物医学和药物传递等方面具有重要的应用前景，被认为是一种未来革命性的材料。 英国曼彻斯特大学物理学家安德烈·盖姆和康斯坦丁·诺沃肖洛夫，用微机械剥离法成功从石墨中分离出石墨烯，因此共同获得2010年诺贝尔物理学奖。石墨烯常见的粉体生产的方法为机械剥离法、氧化还原法、SiC外延生长法，薄膜生产方法为化学气相沉积法

石墨烯TiO2

• 目的
  • 菌能力也应加以考虑
  • TiO2具有产生活性氧物种（ROS）的光催化活性，但产生的电子和空穴的复合限制了其抗菌能力。石墨烯（GDY）复合TiO2纳米纤维，增强光催化和延长抗菌能力，在细胞粘附和分化方面表现出优异的生物相容性和骨诱导能力。
  • 根据最近的统计，近40%由金黄色葡萄球菌引起的骨科植入物相关感染是耐甲氧西林的形式，新的耐药机制的不断增加增加了感染性疾病治疗的难度
  • 尽管与TiO2纳米纤维相比，TiO2 GDY的光催化抗菌效果没有显著改善，但TiO2 GDY的综合特性使其在体内治疗方面更有效。
  • 植入物的抗
• 原理
  • 材料
    • tio2
      • 理论上，作为光催化材料的TiO2可以在紫外线照射下产生活性氧物种（ROS）来杀死细菌12，而产生的电子和空穴的复合会降低TiO2的光催化性能并限制其实际抗菌效果13
      • 仅TiO2的光催化作用是非常短暂的，因此受到限制12，38。研究人员已将抗生素和金属纳米颗粒引入钛植入物支架上，以提高抑菌效果，但这些研究仍显示出不同的缺陷14，15。
      • TiO2也是一种被广泛开发的具有光催化性能的半导体金属氧化 物
    • 复合
      • TiO2/GDY纳米纤维表现出优异的光催化性能，并增加了光催化活性氧的产生。大量产生的ROS会导致细胞成分氧化和细菌细胞壁穿孔，从而导致膜渗漏、结构破坏，最终导致细菌死亡。
      • TiO2/GDY的抗菌作用随着惊人的持续ROS释放而延长，从而防止耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）生物膜的形成
      • TiO2也是一种广泛开发的具有光催化性能的半导体金属氧化物41。通过紫外线照射，电子从价带激发到导带，产生电子-空穴对。自由电子迁移到TiO2表面并参与氧化还原反应，产生ROS，如羟基自由基、超氧阴离子和过氧化氢（H2O2）12。然而，TiO2中电子和空穴的高复合率限制了其光催化抗菌效果。已开展研究以提高TiO2的光催化效率，例如通过减小颗粒尺寸42、修饰纳米级表面以及掺杂Cd或其他元素43-45。
        • 作为唯一包含sp和sp2杂化碳原子的二维碳纳米材料，GDY具有刚性碳网和自然带隙，其结果是大的比表面积和高的空穴迁移率22、23、40、46。优异的导电GDY组合使得在UV照射下TiO2上产生的自由电子容易吸附在GDY表面上
          • 从而降低了复合速率，增强了光催化性能
    • GDY
      • ，GDY的特殊sp和sp2杂化碳原子赋予了石墨烯独特的电子结构和优异的导电性，这对电子转移非常有利，并增强了金属及其氧化物的催化作用18–23
      • GDY也具有骨诱导潜能
  • TiO的表征和光催化性能2 /GDY
  • 成骨作用
    • 。碱性磷酸酶（ALP）是成骨分化过程中成骨细胞 活性最广泛的生化标志物33.
    • .吸附的地塞米松可 诱导骨分化过程中所需的蛋白和酶的表达，从而导致矿物沉积 的增加35.这些结果证实了TiO2/GDY纳米纤维具有优异的骨诱导 性能，值得成为理想的骨再生植入材料。A
      • 。随着TiO 中GDY比值的增加2/GDY化合物，对成骨分化的主要有效分子地 塞米松的吸附作用更强。
    • ALP、骨钙素（氰酸盐 ）、Osterix（OSX）和胶原蛋白1a（Col1a）都是骨重塑早期的 成骨标志物36,37.实时时间-qpcr检测显示，两种TiO2/GO和 TiO2/GDY可以增强
    • H&E染色图像也显示了不 同组的骨重塑水平(补充图。17).GDY + UV和GO + UV组在种植 体周围均有巨大的新骨形成，但仍有未愈合的骨缺损。我们将
      • 此归因于在没有TiO的情况下，杀菌作用不足和非支持性结构2 纳米纤维。
    • 道，在组织再生的早期阶段，亲水表面的高表面能 可以加强与细胞和蛋白质的相互作用54.碳基纳米材料已成为提 高膜表面亲水性的有效策略55–57.因
      • 具有高亲水性的支架材料表面有利于细胞的粘附和增殖
    • 成骨基因的表达在更亲水的表面增加6
    • 此外，一 些碳基纳米材料，如石墨烯，可以通过蛋白质或骨诱导组分吸 附促进成骨分化62
      • 在本研究中，GDY组合提高了纳米纤维的表 面亲水性，并由于共轭π键体系增加了小分子的吸收。
    • 。由于GDY表面的负电位，它将有利 于钙的沉积63.
  • ROS作用
    • 当ROS的氧化能力超过抗氧化剂时，就会发生细胞氧 化损伤或氧化应激。如果氧化应激破坏了ROS的产生和解毒之间 的平衡，细胞的活力就会下降。ROS通过干扰细菌代谢、细胞壁 增殖和诱导DNA损伤来抑制细菌47
      • 例如，羟基自由基可以附着在细胞壁上，从而通过钾离子的快速释放或细胞内CoA酶的氧化和降解导致细胞破坏12,49。在本研究中的SEM图像上，通过光催化处理在细菌表面发现凹坑（图3e）。紫外线照射1小时后，细菌结构被破坏（补充图9a）。此外，由于ATP是呼吸作用产生的细胞代谢的基本能量来源，TiO2/GDY+UV组的最低ATP水平表明细菌代谢受到显著抑制（补充图9b）。
    • 氧自由基（如：·OH、·O2）的杀菌效果−, ·OOH）通常是瞬态的。然而，所产生的H2O2具有较长的寿命，并且在UV关闭后具有持续的杀菌效果52。因此，使用后观察到持续的抗菌效果并不令人惊讶。
    • 由于其独特的共轭π键体系和共轭二乙炔键， GDY已被证明对细胞内自由基有长期的清除作用60
      • 们推断，与在很短的时间内具有强大的光催化作用 相比，纳米纤维中GDY组分对自由基的清除作用几乎可以忽略不 计。
      • ，在骨组织的长期植入期间，自由基的清除特性 使纳米纤维的细胞毒性低于纯TiO2.因此，TiO2/GDY不仅对ROS 的产生具有光催化抗菌作用，而且具有长期的组织再生指导特 性
  • 载药能力
    • 此外，GDY纳米片具有较高的比表面积，表明其 具有更好的载药能力64
• 制备方法
  • 具有较高的体内结构稳定性
    • 通过静电力将GDY组装到TiO2上
    • 我们将TiO2纳米纤维的zeta电位改为正，将新型二维碳基纳米材料GDY的电荷改为负，以合成GDY结合的TiO2异质结，以增强光催化效应39，40
    • 复合材料在350°C下煅烧2小时后，由于其化学作用、氢键和范德华力，TiO2和GDY之间产生了强烈的相互作用。这导致在体内实验中具有高结构稳定性的复合材料。
  • 化学键分析表明
    • TiO2/GDY化合 物成功合成了GDY化合物2纳米纤维。脱掉它2/GDY保持了一个较 大的纳米结构
  • 在磁力搅拌下，将4g钛酸四丁酯（TBT）和1.5g聚乙烯吡咯烷（PVP，MW=1.3×106）添加到乙醇（20g）和乙酸（4g）的混合溶液中5小时。然后，将获得的透明淡黄色溶液转移到20mL注射器中。静电纺丝装置的电压和溶液的进料速率为20kV和2.5mL h−分别为1。针到静电收集器的距离为10cm。将收集的TiO2纤维前体在空气中在550℃下热处理2小时，以制备TiO2纳米纤维。
  • 本研究中使用的GDY由中国科学院化学研究所提供65。使用zeta电位分析仪测量pH为4的水中TiO2和GDY的zeta电位，其为+15.1 mV−分别为19.2mV。
  • 通常，将TiO2纳米纤维（200mg）分散在pH＝4的水中，然后在室温下磁力搅拌1小时。同时，在超声辐照下，将10mg GDY分散在水（30mL）和乙醇（60mL）的混合溶液中2小时。然后，通过剧烈搅拌1小时，将一定量的GDY溶液添加到TiO2悬浮液中。TiO2和GDY进行静电自组装。
  • 随后，除去溶剂。将获得的复合材料在350℃下煅烧2小时。
  • 我们在植入前用紫外线照 射处理受mrsa污染的纳米纤维，以完全消除病原体，避免紫外 线照射造成的不必要的组织损伤。
• 表征方法
  • TiO2/GDY的接触角为15°，远小于TiO2的接触角（49°）（图1g）
  • 材料表征和光催化性能。TiO2/GDY的微观结构通过TEM（Titan G2 60-300）进行了表征。通过拉曼光谱（Renishaw Co.RM1000）检测分子结构。通过接触角仪（Powereach®JC2000C1）检测TiO2/GDY和TiO2纳米纤维的表面接触角。进行RhB降解试验以检测TiO2/GDY和TiO2纳米纤维的光催化活性。1 mL 8μg m L−将1 RhB溶液和100μ−2分钟）（银珠，UVEC-4II，中国）。每个样品以1000×g离心5分钟。通过UV分光光度计（SOPTOP，UV2800，中国）检测上清液的吸光度。TiO2/GDY和TiO2纳米纤维生成·OH和·O2的能力− 在室温下使用ESR（Bruke，emx nano）和5，5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物（DMPO）作为自旋捕获试剂，在300W氙灯照射下分别在水和甲醇中测量。为了测量1O2和·OOH的生成，使用2，2，6，6-四甲基哌啶（TEMP）和DMPO作为捕获试剂。在室温下使用ESR（Bruke，a300）在水中进行测量。用铁离子滴定法对H2O2的生成进行了表征。将15毫克光催化剂悬浮在15毫升H2O中并超声处理5分钟。首先用高纯度O2鼓泡悬浮液30分钟，然后用300瓦氙灯照射3小时。每1小时测量一次H2O2浓度。熄灯后，也在30和60分钟内连续测试H2O2水平
  • 细胞形态和活力。小鼠源性成骨样细胞MC3T3E1在α-最小基本培养基（Hyclone，Thermo Fisher Scientific Inc.）中培养，补充10%FBS（FBS，Gibco），并在5%CO2和95%空气中于37°C的加湿培养箱中保持。MC3T3-E1细胞在共聚焦培养皿上以每皿6×104细胞的密度与20μ−1 TiO2/GDY或TiO2纳米纤维24小时。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤后，在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟。去除PFA并用PBS洗涤，然后用−20°C丙酮5分钟。
  • F-actin和细胞核分别用FITC Phalloidin（Yeasen，40735ES75）和DAPI染色，并通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM，Leica-LCS-SP8-STED）观察。
  • 以每孔2×104个细胞的密度将细胞接种在24孔细胞培养板中的玻璃盖玻片上。20μg m L−1将TiO2/GDY或TiO2纳米纤维添加到没有UV照射的细胞中，接受UV（365 nm，2 W c m−2） 或在添加前接受UV照射。孵育24小时后，用1×分析缓冲液冲洗玻璃盖玻片3次。然后，将盖玻片与2μM钙调素AM和1μM碘化丙锭（PI）在1×分析缓冲液中在37°C下孵育15分钟。使用荧光显微镜（Zeiss Axio Imager A2）拍摄图像。通过图像J计数活细胞和死细胞的数量。通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定评估细胞增殖。
  • CFU毫升−1个MRSA细胞与100μ−1 TiO2/GDY或TiO2纳米纤维并暴露于UV下5分钟。将500微升细菌悬浮液接种到10%聚-L-赖氨酸预处理的玻璃盖玻片上，并孵育24小时以形成细菌生物膜。然后用PBS洗涤生物膜，并在4℃下用2.5%戊二醛固定过夜。样品用水洗涤3次，然后冷冻干燥。随后，用金溅射涂层，通过SEM（TESCAN VEGA 3 LMU）在20kV的加速电压和10.5mm的工作距离下观察样品。进行结晶紫染色以半定量评估生物膜的形成。
  • TiO的表征和光催化性能2 /GDY
    • 透射电子显微镜（TEM）来显示制备的TiO2/GDY的微观结构。TEM图像证实TiO2纳米纤维和GDY已成功自组装，
      • 纳米纤维的直径约为150 nm
    • 利用拉曼光谱确定了TiO2/GDY的分子组成
    • 通过罗丹明B（RhB）降解试验测量了TiO2 GDY和TiO2纳米纤维的光催化活性。
      • 更加吸光，所以颜料降解颜色更快
        • 降解RhB越快光催化活性越强
    • 电子自旋共振（ESR）谱表明，表明ROS（·OH，·O2−, 1 O2和·OOH）生成能力在GDY组装后显著增强（图1f和补充图1）。
      • ·OH、·O2的信号−, 1 O2和·OOH在UV照射下比来自TiO2的强，
    • 检测了 TiO在细胞内的ROS的产生能力2/用荧光ROS探针（DCFHDA）进行 GDY处理的细菌
      • GDY修饰增加了紫外线照射 下MRSA中ROS的生成
  • TiO上细胞的形态和活力2 /GDY.调查 细胞粘附
    • 采用小鼠来源的成骨细胞样MC3T3-E1细胞进行体外评价。
      • 用TiO法培养细胞2/GDY或 TiO224 h后，用异硫氰酸荧光素（FITC）-荧光素染色细胞骨架 ，观察细胞形态。与用TiO培养的细胞进行比较2，TiO上的细胞 2/GDY纳米纤维倾向于聚集和粘附更多。与对照组相比，附着的 细胞表现出更多的扩散、丝状伪足延伸和细
      • 扫描电镜图像显示，细胞可以粘附在两种TiO上2和 TiO2/GDY.但它们在TiO上的粘附和扩散时间较晚且较紧密 2 /GDY比TiO上2（图2b)。
      • 如图中(图中所示。2c)，细胞倾向于 在TiO上扩散2/GDY的膨胀接触面积，以及表面亲水性的增加归 因于GDY。此外，在TiO上粘附的细胞也更多2/GDY比TiO上2(补 充图。3b
      • 对不同GDY重量比的TiO2/GDY进行的CCK-8分析表明，本研究中使用的TG0.5即使在高浓度下也显示出良好的生物相容性（补充图5）。
    • 细 胞骨架染色、扫描电镜图像和细胞增殖分析显示，TiO2/GDY纳 米纤维有利于细胞的粘附和增殖(图。2).植入材料在体内的扫 描电镜结果进一步验证了TiO良好的引导性能2/GDY为细胞粘附( 图。5c).
    • 虽然MRSA可能倾向于粘附在纳米纤维上，但通过光催 化作用在材料上产生的ROS可以在瞬间有效地消除细菌。
  • TiO的光催化抗菌作用2 /GDY体外。
    • 此，我们使用MRSA来探索TiO 的抗菌能力2/GDY，建立耐药细菌相关植入物感染模型。
      • 标准平板计数分析结果表明，经纳米纤维预处理和紫外线照射后，活菌数量显著减少。
  • TiO的生物膜根除效果2/GDY
    • 对光催化处理后的MRSA生物膜进行活/死染色分析，我们发现紫外线照射后的TiO2 GDY破坏了约76%的生物膜（图3c）。
    • 研究生物膜的形成。经光催化预处理后，MRSA（抗药性金黄色葡萄球菌）细胞在载玻片上培养24小时，并固定用于SEM扫描和结晶紫染色
      • 的扫描电镜图像 脱掉它2/GDY + UV组显示有几个单一的菌落，而那些 其他类群有几个集群和多个菌落。用结晶紫染色法进行的半定 量评价也显示了TiO2/GDY +紫外基团的生物膜形成最少。
      • 中，在光催化处理基 团上观察到凹坑，特别是在TiO中2/GDY与紫外线照射。我们将 这些凹坑归因于ROS引起的细胞壁穿孔32.
    • 光催化处理后0、 1h对单个细菌的扫描电镜扫描显示，TiO2/GDY +紫外线处理破 坏了MRSA的细胞结构(补充图。9a).
      • 由于近紫外线照射产生的 ROS数量较少，PBS +紫外线处理也能诱导细胞壁穿孔，但没有 TiO那么严重2/GDY + UV.此外，TiO的胞内三磷酸腺苷（ATP） 的生成减少2/GDY + UV组显示细胞代谢被破坏
  • TiO的成骨作用2/GDY
    • 我们用TiO处理MC3T3-E1细胞2/GDY或TiO2纳米纤 维，培养14天
      • ALP染色试验显示
        • TiO2/gdy处理 组ALP水平较高。
      • 茜素红S（ARS）染色显示，
        • TiO2/GDY 处理的MC3T3-E1细胞的钙沉积和矿化结节几乎是TiO的近两倍2 组(无花果。4a, c).
      • 此外，紫外线照射对材料的预处理对细胞成骨分化没 有显著影响(补充图。10)
    • 石墨烯具有预浓缩成骨诱导剂如地塞米松和β- 甘油磷酸盐以促进成骨分化的能力3
      • 通过紫外分光光度法测定了TG0.5、TG0.25和TiO2纳米纤维负载地塞米松的能力。吸附等温线显示，孵育1天后，TG0.5具有最高的地塞米松吸附量（图4d）。
      • ALP、骨钙素（氰酸盐 ）、Osterix（OSX）和胶原蛋白1a（Col1a）都是骨重塑早期的 成骨标志物36,37.实时时间-qpcr检测显示，两种TiO2/GO和 TiO2/GDY可以增强
        • 而TiO2/GDY处理对ALP的 表达有更好的增强(补充图。11)，这也被ALP染色所证实
  • TiO的抗菌和成骨作用2 /GDY体内
    • 建立了植入相关感染模型来验 证纳米纤维的体内治疗效果。
      • 计算植入股骨磨液 中的菌落
        • 。平板计数结果显示，TiO中MRSA减少了85%2/GDY+UV 处理股骨比PBS组，优于GO + UV，GDY + UV，TiO2/GO + UV， 和TiO2+ UV组(图。5a、b；补充图。12、13)，这表明 TiO2/GDY在植入过程中MRSA污染的条件下，紫外线照射能有效 抑制细菌感染。
    • 探索纳米纤维在体内的细胞相容性
      • 在植入后5天用 扫描电镜扫描植入的纳米纤维(图。5c)
        • .与体外观察结果一致， 细胞似乎牢固地附着在gdy组装的纳米纤维的表面
      • ，我们 使用苏木精-伊红（H&E）染色来揭示股骨感染的病理特征
        • 图 5d显示了PBS、PBS、+、UV和TiO2+ UV组在骨缺损区均有明显的 感染区和坏死区（橙色虚线），而TiO2/GDY + UV组显示少量炎 症细胞浸润。此外，TiO2/GDY + UV组的新骨再生面积最宽(蓝 色虚线，图。5d和补充图。14和15)。免疫组化分析成骨标志物 骨桥蛋白（OPN）的表达，发现TiO中有许多OPN阳性细胞2/GDY 植入股骨(图。5d和补充图。14).以上所有的结果都证实了 TiO2/GDY提供了良好的骨诱导微环境
        • 在生物体内进行的相比之下，没有紫外线照射，股骨几乎没有 新骨形成，并充满了感染性组织(补充图。14a)，这证明了在骨 感染过程中抗菌过程的重要作用。
    • 评估骨再生状态
      • 马森染色 评估骨再生状态。
        • PBS集团仍然有一个 未愈合的孔和骨髓坏死组织的慢性感染(图。5e).然而，骨缺损 植入了TiO2/GDY完全愈合，产生了大量的新骨（虚线框中的蓝 色染色）。相比之下，PBS +的UV和TiO的骨量2+ UV组存在不足 ，骨再生过程非常缓慢(补充图。16)
      • 16).H&E染色图像
        • 像也显示了不 同组的骨重塑水平(补充图。17).GDY + UV和GO + UV组在种植 体周围均有巨大的新骨形成，但仍有未愈合的骨缺损。
      • 收集小鼠的器官，用H&E染色观察
        • 以进行组 织学毒性评估(补充图。18).纳米纤维植入组与PBS对照组之间 无显著性差异。这表明，纳米纤维的系统毒性可以忽略不计。
  • ROS生成
    • ROS的生成还包括 ·OH、·O2− , 1O2、·OOH和H2O2采用ESR法和铁离子滴定法进 行了检测。
• 讨论
• 预浓缩骨诱导剂（如地塞米松和β-甘油磷酸）