17.干细胞及其应用

干细胞及其应用，干细胞(stem cell)是指 具有无限或较长期的自我更新(self-renewal) 能力,并在一定条件下产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。

干细胞及其应用 (Stem cells and their)

• 干细胞概述 (Overview of stem cells)
  • 一、干细胞的定义(Definition of stem cells)
    • 1.定义
      • 干细胞(stem cell)是指 具有无限或较长期的自我更新(self-renewal) 能力, 并在一定条件下产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。
      • 它存在于人体或动物个体发育各个阶段的组织器官中, 是各种分化细胞或特化细胞的初始来源。
    • 2.干细胞的分类(classification of stem cells)
      • 根据分化潜能及产生分化细胞能力的不同
        • ·全能干细胞(totipotent stem cell)
          • 能发育为一个完整个体的原始细胞。 如受精卵、人体8-16细胞以前的卵裂球
        • ·多能干细胞(pluripotent stem cell)
          • 来源于早期囊胚腔的内细胞团,虽然失去发育为完整个体的能力,但理论上具有分化形成个体中各种细胞的潜能。 如胚胎干细胞(ES cell)
        • 专能干细胞(monopotent stem cell)
          • 只能分化成相应组织器官组成的细胞 如:骨髓基质干细胞(MSC)、造血干细胞、肝干细胞、神经干细胞等。
        • ·单能干细胞(unipotent stem cell)
          • 只能向密切相关的一种或少数几种类型的细胞分化的细胞,与分化细胞不同的是具有自我更新能力。 如:皮肤组织基底层干细胞、肌肉中成肌细胞等。
      • 根据细胞来源时期不同
        • 胚胎干细胞(embryonic stem cell;ES cell)
          • 存在于早期胚胎组织中、具有高度增殖能力和多向分化潜能,但尚未分化的干细胞。
        • 成体干细胞(adult stem cell)
          • 存在于成体各组织器官的未分化细胞,在体内具有终生自我更新能力和分化潜能。
  • 二、干细胞的生物学特性
    • (一)干细胞的形态和生化特征
      • 1.形态特征
        • 通常呈圆形或椭圆形,体积较小,核质比例相对较大。
      • 2. 干细胞的生化特征
        • 干细胞都具有较高的端粒酶活性。
        • 不同的干细胞具有不同的生化标志。
          • 如:nestin为神经干细胞的标志分子 ; 角蛋白15是确定毛囊中表皮干细胞的标志分子; CD34是造血干细胞的标志分子等等。
        • 干细胞的生化特性常被用作鉴定干细胞在组织中的存在和评价其分化程度的标志
    • (二)干细胞的增殖特性
      • 1.缓慢性
        • 干细胞自身的增殖非常缓慢。
        • 一般情况,干细胞处于休眠或缓慢增殖状态,当其接受刺激而进行分化时,需产生过渡类型细胞再到分化细胞。
        • 意义
          • 有利于干细胞对特定的外界信号作出反应,以决定进行增殖还是进入特定的分化程序。
          • 可以减少基因发生突变的危险,使干细胞有更多的时间发现和校正复制错误,具有防止体细胞自发突变的作用。
        • 在干细胞到分化细胞的发育过程中有两种过渡类型的细胞
          • 过渡放大细胞
            • 分裂速度快。
            • 意义:可使少量干细胞产生较多的分化细胞,同时保护干细胞。
          • 祖细胞
            • 为前体细胞,经过几次分裂后,产生的细胞为终末分化细胞。
      • 2.自稳性
        • 干细胞通过自我更新以维持自身数目恒定。
        • 是区别于肿瘤细胞的本质特征。
        • 对称分裂(symmetry division):当干细胞分裂时,产生的2个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞。
        • 不对称分裂(asymmetry division):当干细胞分裂时,产生一个子代干细胞和一个子代分化细胞
        • 在正常生理状态下,干细胞多以不对称分裂方式用于补充组织在自我更新过程中衰老和死亡的细胞。 (不对称分裂使机体对干细胞的调控更具有灵活性,可以更灵活地应对机体生理变化的需要。)
        • 在创伤等应激状态时,由于需要大量的细胞代替和补充坏死的组织细胞,干细胞的分裂方式 可能就不再局限于不对称方式,可以以对称分裂的方式快速增殖。
    • (三)干细胞的分化特性
      • 1.分化潜能
        • ·干细胞分化具有多潜能性,不同干细胞的分化潜能不同。·干细胞可按其分化潜能分为:全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞和单能干细胞。
      • 2.转分化和去分化
        • 目前的研究发现,成体干细胞具有一定的可塑性(plasticity),即不同组织来源的成体干细胞之间可相互转化。 包括干细胞的转分化和去分化。
        • 一种组织类型的干细胞在适当条件下可以分化为另一种组织类型的细胞,称为干细胞的转分化。
        • 1997年,研究首次证明成年动物的造血干细胞可分化成为脑的星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。 目前,类似的发现还包括成体造血干细胞分化成为肌细胞、肝细胞；神经干细胞转化为造血干细胞等等。
  • 三、干细胞增殖与分化的调控
    • 内源性调控-转录因子网络
    • 细胞微环境
      • 细胞因子
      • 细胞间相互作用
      • 细胞外基质
• 各类干细胞及其特性 (Stem cells and their properties)
  • 一、胚胎干细胞
    • 胚胎干细胞(embryonic stem cell;ESC) 是指从着床前的内细胞团或原始生殖细胞获得的具有多向分化潜能和较长期地进行自我更新的细胞。
    • 包括:囊胚细胞团的胚胎干细胞(ES细胞) 早期胎儿(5-9周)原始生殖嵴的生殖干细胞(EG细胞) 异常胚胎干细胞——畸胎瘤细胞
    • (一)生物学特征(biological property)
      • 1.形态特征
        • 圆形;细胞体积小;核质比例高,细胞核明显,有一个或多个核仁,染色质较分散; 核型正常、二倍体;细胞质内散布着大量的核糖体和线粒体。
      • 2.生长特征
        • 胚胎干细胞增殖迅速,体外培养细胞呈集落状生长,紧密堆积在一起,无明显细胞界限,形似鸟巢。
        • 关键:维持干细胞的未分化状态。
        • 饲养层细胞(成纤维细胞株)培养体系
      • 3.生化特征
        • 表面抗原:胚胎阶段性特异抗原(stage-specific embryonic antigens,SSEA)
          • SSEA是一种糖蛋白,在胚胎发育早期表达,常作为胚胎干细胞的标志之一,具有种属特异性。
          • 如:人的ES细胞表达SSEA-3、SSEA-4,而小鼠的ES细胞表达SSEA-1;
        • 碱性磷酸酶(AKP)
          • 碱性磷酸酶(AKP)是鉴定胚胎干细胞分化与否的标志之一。
        • 端粒酶
          • 胚胎性干细胞端粒酶持续高水平表达;使这些细胞在分裂后保持端粒长度,维持细胞的分裂增殖能力
        • 表达OCT4、SOX2、Nanog、STAT3等
        • 无X染色体失活
      • 4.分化潜能
        • 人胚胎干细胞具有分化形成外、中、内三个胚层的潜能,
        • (1)体内分化
          • 将胚胎干细胞注射到同源动物或严重免疫缺陷的小鼠的皮下或肾囊中,在注射部位可形成畸胎瘤。
          • 检测畸胎瘤组织可观察到来源于三个胚层的不同的细胞类型。 如:胃上皮(内胚层)、平滑肌和横纹肌(中胚层)、神经表皮和神经节(外胚层)。
        • (2)嵌合体的形成
          • 将供体的胚胎干细胞注入受体胚泡中,然后转移到假孕母体子宫中进一步发育,可得到嵌合体动物,该动物身体中既可观察到供体的组织细胞,又有受体的组织细胞。
          • 嵌合体动物的形成是鉴定细胞是否具有多能性的最有说服力的实验证据。
    • (二)胚胎干细胞定向诱导分化
      • 定向分化:在适宜条件下,使胚胎干细胞按照人们的意愿分化为某一特定谱系的细胞,称为胚胎干细胞的定向分化。
      • 胚胎干细胞定向分化的常用策略是改变细胞的微环境,目前主要从三方面进行
        • 1.在体外培养时改变细胞培养条件
          • 向培养基中加入不同种类的生长因子及化学诱导剂。 如:表皮生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、维甲酸、二甲基亚砜等等。 诱导剂可单独或配伍使用,诱导物不同,干细胞的分化方向亦不同。
          • 将胚胎干细胞与其他细胞一起培养,并加入不同类型的细胞来诱导细胞分化。
          • 将细胞接种在适当的底物上。
          • 这些因素将促使胚胎性干细胞沿着某一特定谱系进行分化。
        • 2.导入外源性基因来激活细胞的特定分化
        • 3.体内定向分化
          • 即将胚胎性干细胞移植到动物体内的某一部位, 在体内的细胞诱导等不同的微环境中,分化为该部位相应的特异细胞。 如:将小鼠ES细胞直接移植到帕金森病大鼠模型的心脏和纹状体,成功地分化为相应的心肌细胞和神经元。
    • (三)胚胎干细胞研究的意义及伦理道德争议
      • 意义
        • 研究哺乳动物个体发生发育规律 研究细胞分化 研究基因功能 生产转基因动物 ES细胞治疗性克隆 研究细胞癌变机理及新药物的筛选
      • 胚胎干细胞技术的发展方向
        • ES细胞维持自我更新和定向分化的分子机理 ES细胞治疗技术的研究 ES细胞作工具探讨基因功能和个体的发生发育 ES细胞治疗中的免疫排斥问题 治疗型克隆技术 分离ES细胞新途径的研究 用ES细胞生产转基因家畜
      • 人胚胎干细胞的主要来源
        • 囊胚期胚胎的内细胞团(主要途径) 小鼠和人的原始生殖细胞(定向培养) 体细胞的核移植技术 早期的胚胎细胞(小鼠的卵黄囊细胞)(诱导去分化)
      • 胚胎干细胞的应用前景
        • 药物实验 细胞治疗 器官移植研究 发育过程中的基因表达和调控的理想模型
      • 胚胎干细胞的伦理学问题
        • 允许
          • 1.从人胚胎组织中获得新细胞系 2.使用私人资助、己经获得的来自人胚的细胞系进行研究 3.允许新生儿脐带血中提取造血干细胞 4.允许新生儿胎盘组织提取亚全能干细胞
        • 禁止
          • 1.使用来自胎儿组织的细胞系进行研究 2.用干细胞创建人胚胎的研究 3.将人胚胎干细胞与动物胚胎结合的研究 4.使用干细胞进行生殖克隆 5.来自为研究目的而专门创建的胚胎的干细胞有关研究
  • 二、成体干细胞 (adult stem cell)
    • 成体组织或器官中具有自我更新能力及能分化产生一种或一种以上子代组织细胞的未成熟细胞。
    • 成体干细胞的进一步分化是成年机体组织损伤修复和再生的保证,维持组织细胞功能的稳态。
    • 干细胞广泛存在于各种组织中。
    • (一)造血干细胞(haematopoietic stem cell,HSC)
      • 存在于骨髓、外周血、脐带血中
      • 造血干细胞的主要分选标志:CD34⁺、CD38⁻
      • 白血病移植治疗:HLA配型
    • (二)骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cell,bMSC)
      • 又称骨髓间充质干细胞
      • 主要存在于骨髓中
      • 细胞表面表达CD105、CD73、CD90等分子标记
      • 取材方便,容易体外培养,具有多向分化潜能
    • (三)神经干细胞(neural stem cell,NSC)
      • 主要存在于脊髓、大脑皮层等
      • 主要标志分子:巢蛋白(nestin)、EGF受体、FGF2受体
  • 胚胎干细胞与成体干细胞的比较
    • 相同点
      • 成体干细胞和胚胎干性细胞一样,具有自我更新的能力, 并可在适宜条件下分化形成特殊形态和特定功能的子细胞(分化潜能)。
    • 不同点
      • 两者的来源不同。这是最根本的区别。胚胎性干细胞来源清楚,成体干细胞来源有待进一步研究证明。 两者增殖能力有差别。胚胎性干细胞可无限增殖;而成体干细胞的增殖能力则很有限。 两者分化潜能有差别。胚胎性干细胞的分化潜能高于成体干细胞。
  • 三、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSc)
    • 最初是日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct3/4,Sox2,KIf4和c-Myc)的组合转入分化小鼠皮肤成纤维细胞中,使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。
    • 2007年Thomson选用OCT3/4、Sox2、Nanog和Lin28也取得成功。
    • 这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而 被重编程到具有多能性的状态，因而受到了整个生命科学领域的广泛关注。
    • 2007年11月,美国和日本科学家分别宣布独立发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法， 得到的干细胞称为诱导多功能干细胞,这一发现分别被《自然》和《科学》杂志评为2007第一和第二大科学进展。
    • iPS研究领域潜在的一些障碍: 重编程效率低下,诱导突变,重编程细胞无法分化形成某些细胞类型,构建的并非总是理想的疾病模型等。
    • iPS细胞:人造肿瘤细胞? Yamanaka研究组在《自然·生物技术》上发表的文章显示,用iPS细胞诱导的神经干细胞,即使不含c-myc(曾被认为是导致肿瘤的主要原因),在植入NOD/SCID免疫缺陷小鼠后仍有很强的致瘤性,甚至高于胚胎干细胞。
• 干细胞与医学 (Stem cells and medicine)
  • 肿瘤干细胞(Cancer stem cell)
    • 肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC):存在于肿瘤组织中的具有干细胞性质的肿瘤细胞群体, 具有自我更新的能力,是形成不同分化程度肿瘤细胞群体、肿瘤不断扩大和转移的源泉。
    • 肿瘤干细胞学说
      • 肿瘤组织中存在极少量在肿瘤中充当干细胞角色的肿瘤细胞,具有无限增殖的潜能, 在启动肿瘤形成和生长中起着决定性作用；而其余大多数细胞,经过短暂的分化,最终死亡。
    • 肿瘤干细胞的来源
      • 干细胞起源假说:正常干细胞突变而来。
      • 分化祖细胞和成熟体细胞起源假说:肿瘤细胞起源于单个正常体细胞发生了突变后形成的后代子细胞(后裔)。
      • 异常融合细胞起源假说
    • 肿瘤干细胞研究的意义
      • 有助于阐明肿瘤发生、发展的机制。
      • 有助于抗肿瘤药物的研发。
      • 有助于肿瘤治疗。
    • 针对肿瘤干细胞的靶向治疗
      • 细胞表面抗原靶向治疗。
      • 诱导针对肿瘤干细胞的特殊免疫反应。
      • 针对肿瘤干细胞信号通路的靶向治疗。