生物化学-分子生物学研究法1

关于生物化学-分子生物学研究法1的思维导图，DNA、RNA及蛋白质操作技术，希望这份脑图会对你有所帮助。

分子生物学研究法1

• DNA、RNA及蛋白质操作技术
  • DNA基本操作技术
    • 基因组DNA的提取
      • - 基因组DNA提取：细胞核内染色体上包括编码区和非编码区在内的全部DNA分子 - 主要流程： - 研磨 - 动物组织、细胞材料----研磨匀浆 - 植物组织----液氮研磨 - 氯仿、苯酚抽提 - 取水相，乙醇洗涤 - 晾干，加TE缓冲液或超纯水溶解
    • 核酸凝胶电泳
      • - 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，按分子量大小分离DNA - 分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用 - 分离和确定大小
      • 原理
        • - 电泳迁移率 与电泳分子本身携带净电荷数正比；与片段大小反比 - DNA和RNA为多聚阴离子，在电场中向正极迁移 - 电泳后DNA分子的显色 - EB 插入DNA分子中，在紫外光照射下呈现橘黄色荧光；替代物：Goldview、sybgreen、gelred - 感受态细胞的制备 - CaCl2法 0℃氯化钙；42℃热激；筛选阳性克隆（蓝白斑筛选） - 电击法 电脉冲 细胞膜上疏水孔洞 - 基因工程噬菌体导入
    • PCR
      • 快速扩增DNA序列 - genomic PCR PCR反应模板是基因组上某个片段 - RT-PCR mRNA反转录产生cDNA
      • 原理
      • 步骤
        • - 变性（DNA解链） 高温（>94℃）1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA - 退火（引物与模板DNA结合） 降低反应温度（退火，越50℃），1min，使寡核苷酸引物与两条单链DNA模板结合在 靶DNA区段两端的互补序列上；引物浓度>>模板量，防止两条模板配对； - 链的延伸（DNA合成） 72℃ 1-数分钟，DNA聚合酶，合成DNA互补链
    • 重组载体的构建
      • - 目的：研究基因功能 - 步骤 - 引物设计、合成 - 选择合适的DNA聚合酶和模板DNA，PCR扩增目的基因（产物单一直接过柱回收，不单一则割胶回收，溶胶后用硅胶膜纯化柱纯化） - 相同的核酸外切酶在适当温度下双酶切目的片段和载体DNA - T4连接酶进行连接反应
    • 实时定量PCR（Q-PCR）
      • Taqman探针
      • 重亚硫酸盐测序
    • 基因组DNA文库的扩建
      • 将某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆称为基因组DNA文库 用途：分离特定基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控、构建全基因组物理图谱、全基因组序列测定 构建方法：λ噬菌体和限制性内切酶部分消化法
  • RNA基本操作技术
    • 总RNA的提取
    • mRNA的纯化
    • cDNA的合成
      • cDNA
    • cDNA文库的构建
    • 基因文库的筛选
      • 通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆过程 方法：核酸杂交法、PCR筛选法和免疫筛选法等
    • 非编码RNA研究
  • 基因克隆技术（新基因的发现与克隆）
    • RACE技术
      • 在已知的cDNA序列的基础上克隆5'或3'端缺失序列的技术，根据已知序列设计基因片段内部特异性引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到的目的序列。扩增5'端的方法为5'RACE，3'则为3'RACE
    • RAMPACE技术
      • 在基因表达的加帽分析技术和RACE技术的基础上进一步优化的实验技术，在全基因组范围内鉴定所有的蛋白质编码基因和部分非编码RNA基因的转录起始位点，确定启动子的具体位置，并且能够通过高通量检测基因表达的方法。
    • Gateway大规模克隆技术
      • 利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了保障 步骤： - TOPO反应 将目的基因PCR产物连入Entry载体。该载体上的CCCTT能被拓扑异构酶识别，切开后通过该酶的274位酪氨酸与切口出的磷酸基团形成共价键，被偶联在载体上。加入PCR产物后，载体上3'末端突出的GTGG与PCR产物的互补性末端接头序列CACC配对，使得PCR产物以正确方向连如Entry载体 - LR反应 目的片段从Entry载体中重组入表达载体
    • 基因的图位克隆法
      • 分离位置性状的目的基因 - 构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点 - 两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记 - 通过不同生态型个体的大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的分子标记 - 通过染色体步移技术将位于这两个标记间的基因片段克隆出来 - 根据基因功能互作原理鉴定目的基因
    • 热不对称交错多聚酶链式反应克隆T-DNA插入点侧翼序列
      • TAIL-PCR,用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据。 使用一套巢式特异引物（T-DNA边界引物，TR）和一个短的随机简并引物（AD）。 - PCR I - 5轮高严谨性循环，特异性引物TR1与模板退火，只能发生单引物循环，T-DNA上游侧翼序列得到线型扩增 - 大幅度降低退火温度，使AD及TR1均与DNA相结合，指数扩增一个循环 - 2个高严谨、1个低严谨循环交替进行，共15个循环 - 特异性序列（两端分别拥有AD和TR1）和非特异性序列I（只有TR1，没有AD序列）大大超过非特异性序列II(两端均为AD序列) - PCR II - 以TR2为引物与AD配对，进行12个TAIL-PCR循环，特异性序列再次被优先扩增，非特异性序列I也大大降低 - PCR III - 真正意义上的PCR，用TR3为特异性引物与AD配对，共20个循环，进一步扩增特异性序列
  • 蛋白质与蛋白质组学技术
    • 双向电泳技术
      • 分离大量混合蛋白质组分的有效技术；主要依赖于蛋白质等电聚焦（IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）双向电泳技术，通过等电点和相对分子质量分离不同的蛋白质 蛋白质是两性分子，在不同pH缓冲液中表现出不同的电性，在电流的作用下，在以两性电解质为介质的电泳体系中，不同等电点的蛋白质会聚集在介质上的不同区域而被分离。SDS带有大量负电荷，使所有蛋白质带大量负电荷，故蛋白质所带电荷量可以忽略不计。所以，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于其相对分子质量的大小，不同分子质量的蛋白质将位于凝胶的不同区段而得到分离。
    • 荧光差异显示双向电泳技术
    • 蛋白质质谱分析技术
      • - 鉴定电泳分离后的蛋白质；鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰类型与发生位点 - 质谱仪组分：离子源、离子分离区、检测器 - 常用：基质辅助的激光解析电离-飞行质谱；电喷雾质谱 - 回收感兴趣蛋白后，进行胰蛋白酶胶内酶解，收集酶解肽段。**一级质谱**将经蛋白酶降解后的肽段按照*核质比*及*强度*进行解析，形成*肽指纹图谱*（PMF），**每个母离子峰代表一个肽段**，其强度代表了肽段的多少；二级质谱：挑选一级质谱有代表性的母离子峰，以诱导碰撞解离（CID）方式打碎，形成肽段碎片指纹图谱（PFF）。结合一级PMF和二级PFF信息，进行数据库搜索，获得蛋白质具体鉴定信息