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植物细胞工程
植物细胞工程的思维导图，植物细胞工程的发展历程：培养技术探索阶段（1902-1929）、培养技术建立阶段（1930-1959）、培养技术迅速发展阶段（1960-2000）。
编辑于2023-06-05 08:04:46- 生物技术
- 植物细胞工程
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- 大纲
植物细胞工程
植物细胞工程概论
分类
应用范围
创制植物新种质
生产次生代谢产物
保存植物种质
用于基础研究
快速繁殖植物
制作人工种子
使用技术
织物组织与器官培养技术
植物细胞大批量培养技术
植物原生质体培养技术
植物体细胞融合技术
植物体细胞胚诱导技术
植物染色体融合技术
植物细胞器移植技术
植物基因工程技术
植物快繁技术
植物人工种子制作技术
重要领域
研究植物形态建成的实验技术体系
植物再生、生理生化和遗传转化的技术体系
实现了试管开花和结实
原生质体培养是单细胞研究的良好技术体系
利用离体突变技术分离和鉴定与植物发育有关的基因
利用花培加倍单倍体技术获得纯系
建立高效的植物再生体系
植物组织培养技术
植物离体受精技术
研究内容
茎段、幼苗及极大植株的培养
植物组织和器官的培养
植物细胞和原生质体培养以及体细胞杂交
基因工程
基本理论
细胞
植物细胞的全能性
发展历程
培养技术探索阶段（1902-1929）
培养技术建立阶段（1930-1959）
培养技术迅速发展阶段（1960-2000）
生物技术 应用范围
生产新的更安全的疫苗
提高食物营养价值
治疗遗传疾病
提高牲畜生产力
提供更好的新的药物
开发可降解塑料
提高作物产量，降低生产成本
减少水和空气污染
实验室
常用灭菌方法
污染来源
所有培养器皿
培养基
外植体
培养环境
用于培养的工具
操作过程
操作者本身
超净工作台
灭菌方法
物理方法
干热灭菌方法
湿热灭菌方法
间歇灭菌法
高压灭菌法
热力灭菌方法
辐射灭菌方法
过滤除菌方法
化学方法
含氯化合物
过氧化物
醇类
季铵盐类
酚类
醛类
细胞计量与 活力检测技术
培养细胞密度的测定
血球计数板
培养细胞体积的计量
培养细胞鲜重和干重 测定及绘制生长曲线
鲜重法
干重法
植板率
植板率（%）=（平板上形成的细胞团数/平板上接种的细胞数）X100%
平板上接种的细胞数=加入平板内细胞悬浮液的体积（mL）X每毫升内细胞总数
细胞活力检测
酚藏花红染色法
活细胞不着色
死细胞染成红色
荧光双醋酸酯（FDA）染色法
发绿色荧光的为有活力的细胞或原生质体
台盼蓝染色法
活细胞不着色
死细胞染成蓝色
四唑盐（MTT）比色法
活细胞线粒体能把MTT还原成难溶性的蓝紫色结晶物
与细胞数成正比
死细胞不着色
实验室的构成
玻璃、塑料和其他实验器皿洗涤与贮存室
培养基准备和灭菌室
无菌操作室
又称接种室
外间是缓冲室，里间是无菌操作室
培养室
能控制温度、光照和时间
一间光照培养室，一间暗培养室
显微操作和观察室
人工气候室或温室
基本仪器设备器材
全自动高通量植物3D成像系统
设计原则
满足客户的需求
设计合理
功能齐全
保障安全
应用方便
经济实用
基本操作流程
玻璃和塑料器皿的洗涤与灭菌
操作工具的灭菌
植物材料的灭菌
培养基的灭菌
固体培养基
液体培养基
生长素不用高压灭菌
无菌操作室的灭菌
超净工作台灭菌
操作者具体操作过程
培养基
培养基的制备
母液配制：分大量元素、微量元素、铁盐、 有机营养物质、碳源、生长激素等六大类
基本培养基配制（工作浓度）
培养基的分类
根据含盐量的多少
含盐量较高的培养基
特点：较高浓度的硝酸盐、铵盐和钾盐
例如MS培养基
有利于愈伤组织的诱导、生长和细胞培养
范围最广、适应性最强
硝酸钾含量较高的培养基
特点：硝酸钾含量较高
B5培养基含有较低的铵
N6培养基中也含有较低的铵离子
在禾谷类植物的花药、花粉和 原生质体培养中得到广泛应用
适合愈伤组织诱导和细胞培养
含盐量中等的培养基
大量元素含量为MS的1/2， 微量元素种类减少但含量增加
用于根的形成
低盐浓度的培养基
例如white培养基
适合木本植物的组织培养
有利于根的形成
培养基成分对愈伤组织 诱导和形态建成的影响
植物生长调节剂
降低或除去原来细胞增殖培养基中的生长素
调整培养基中生长素/细胞激动素的比例
注意所加激素的绝对量的影响
要注意所用生长意和细胞激动素的种类
提高培养基中的氨舍量及其它盐的浓度
注意顺序改变培养基的激意成分及其它营养物质
有机营养成分
糖的浓度和种类
有机添加物
无机营养物质
氨和铁对某些组织胚状体的形成的作用
无机盐浓度
组成成分
必要的矿物元素
大量元素 - N, P, K, Ca, Mg and S
微量元素 - Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I, Zn, Cl and some times Al, Ni and Si
有机营养物质
含氮物质：维生素类物质和肌醇类
碳源：蔗糖、果糖和葡萄糖等
植物生长调剂物质
生长素
常用生长素
NAA和IBA常与细胞分裂素结合用于芽的增
生长素可溶解在稀NaOH中
细胞分裂素
常用物质
溶于稀酸或稀碱
赤霉素
琼脂
非必要成分
使用浓度0.8—1.0%
类型
固体培养基
液体培养基
pH值
通常为5.0—6.0
pH＜5.0不能很好的胶化
pH＞6.0培养基硬度过大
多采用pH=5.8
选择与筛选
查阅以往的研究确定基本培养基；或 选择一种通用培养基
确定改良培养基的主要成分与浓度变化梯度
正交试验设计进行优化
根据离体诱导物的生长状况以及生长曲线等， 筛选培养基
细胞分化
植物细胞的全能性
定义
植物细胞（体细胞或生殖细胞）均含有该物种全部的遗传信息
每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力
实现途径
以植物的体细胞为培养材料
以植物的生殖细胞为培养材料
培养去壁的原生质体，使原生质体发育成植物体
利用诱导剂，促使两个不同种的原生质体互相融合后进行培养
将遗传信息利用不同基因载体导入植物细胞
细胞分化
细胞分化是指细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程
细胞分化是稳定、不可逆的
表达过程
脱分化
再分化
器官分化
途径
器官分化（或器官发生）途径
胚状体发生（或无性胚状体发生）途径
主要影响因素
基因型是影响植物器官发生、植株再生的主要因素
培养基成分
光照、温度等培养条件有重要调控作用
器官培养
过程
培养材料的采集
快速繁殖中，常用长度0.5vm左右的茎尖作为外植体
脱毒培养中，仅取茎尖长度在0.1mm以下的分生组织部分
培养材料的消毒
制备外植体
接种与培养
无菌环境下，将外植体接种在适宜培养基上，封口培养
环境条件一般是温度25℃左右，光照12h/d
根的诱导
炼苗与移栽
范例
根的培养
离体根培养具有生长迅速、代谢活跃及在已知条件下培养可根据需要增减培养基中成分等特点
茎的培养
茎的培养是指将植物的茎或茎尖分生组织进行离体培养
茎段培养是指带有腋芽或叶柄、长数厘米茎节段的离体培养
叶的培养
胚状体培养的意义
克服杂种胚的败育，获得稀有植物
获得单倍体和多倍体的植株
打破种子休眠，促进胚萌发
快速繁殖良种，缩短育种周期
克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽率
提高后代抗性，改良品质
种子活力的快速测定
种质资源的搜集和保存
用于理论实践
愈伤组织
愈伤组织培养的目的
无性繁殖并大量扩繁被培养的植物
为细胞悬浮培养和次生代谢产物，生产与利用原生质体培养和细胞融合提供易于操作的起始材料
为植物体细胞无性系变异细胞，突变体筛选创造适宜的体系和基础
为外源基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象
为种质资源的保存提供新的形式
为离体研究植物组织和细胞分裂，分化，代谢和状态的转变创造适宜的材料和体系
愈伤组织的形成
诱导期
分裂期
分化期
愈伤组织的类型
质地
疏松易碎的愈伤组织
坚硬/木质化的愈伤组织
水渍粘稠的愈伤组织
颜色
愈伤组织无任何形态结构
新鲜愈伤组织颜色为奶黄色或白色有光泽
少数也有淡绿色或绿色或红色
老化的愈伤组织则转变为黄色至褐色
愈伤组织形态建成的方式
通过产生单极性的不定芽，在再不定芽的下方长出不定根，同时在二者之间形成维管束组织，进而形成完整植株
产生单极性的不定根再在不定，根的上方产生不定芽，并在二者之间分化出维管束组织，形成完整植株
愈伤组织仅分化出不定芽或不定根，而形成无根苗或无苗根
在愈伤组织临近部分分化出不定根和不定芽，然后两者再结合起来，再形成完整植株
通过体细胞胚胎途径再生植株
愈伤组织继代时间与植物再生能力和遗传稳定性
以往研究认为接待时间长，再生能力减弱甚至丧失
继代时间与变异
植物体细胞胚
体细胞胚胎发生的特点
具有两极性
存在生理隔离
遗传性相对稳定
重演受精卵形态发生的特性
植物体细胞胚发生的方式
直接途径
直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成
间接方式
体胚从愈伤组织或悬浮细胞，有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成
调控体细胞胚发生同步化的方式
基因型
外植体
影响体细胞胚发生的效率 影响体细胞胚发生同步化
培养基
光照处理
蔗糖浓度
光照
体细胞胚发育成植株的阶段
发芽
根系的发育
芽分生组织的生长和发育
真叶的生长
根和芽的连接
正常植株生长
植物体细胞胚发生与调控的作用
用于生产人工种子
用作植物遗传转化受体
用于植物的快速繁殖
用于研究植物的细胞分化
体细胞胚萌发的两种不正常现象
体细胞胚不完全萌发
体细胞胚早熟萌发
植物离体培养
植物离体快速繁殖技术的程序
无菌母体制备
不定芽增殖
完整植株形成
再生植株锻炼与移植
再生植株鉴定
影响脱毒效果的因素
母体材料病毒侵染的程度
起始培养的茎尖大小
外植体的生理状态
植物离体快速繁殖技术的关键
防止污染，保证快速繁殖的质量和速度
植物材料预处理
芽的增殖
变异的来源和控制
根的诱导
再生植株的锻炼与移栽
再生植株的鉴定
细胞学鉴定
形态学鉴定
植物培养
花药培养应注意的问题
基因型
生理状态
花粉发育时期
倍性检测
单倍体植株的鉴定与二倍化
鉴定方法
形态学鉴定
染色体分析
单倍体植株的二倍体
继代加倍
创伤法加倍
秋水仙素处理加倍
材料预处理
方法
黑暗处理
光质处理
高渗处理
药物处理和温度处理
作用
可以促进细胞脱分化
提高愈伤组织或体细胞胚诱导率
遗传转化
转基因植株的检测
标记基因
PCR检测
Southern杂交
Northern杂交
生物学鉴定
转基因生物安全与评价
新育种技术的潜力
更精确
只需进行科学的，简约的监管
大幅变快
成本大幅降低
遗传转化的方法
载体法
农杆菌介导法方法
共培养法
叶圆盘法
活体接种法
特点
受体类型广泛
简单易行，周期短，转化效率较高
转化体常出现“嵌合”现象
影响转化效率的因素相对较少
非载体法
基因枪法
类型
火药爆炸式基因枪
高压气动式基因枪
高压放电式基因枪
特点
无寄主限制
受体类型广泛
操作简便，可控程度高
转化频率低，影响因素复杂
基因枪可与农杆菌协同转化
基因枪法进行遗传转化易出现转基因沉默现象
影响因素
轰击参数
转化受体生理状态
操作手法
花粉管通道法
体细胞无性系变异特征
普遍性
多样性
可遗传性
细胞无性系变异
体细胞融合作用
用于有价值植物的遗传改良
野生物种含有许多栽培作物所缺少的有用的和理想的基因
无性系变异的优点
诱变群体大，筛选方便
不收季节限制，筛选效率高
试验的重复性高，诱变和筛选条件可控
诱变频率高，变异幅度大
某些体细胞无性系变异是新出现的
体细胞无性系变异是在单细胞水平上进行的
可拓宽种质资源，加快育种进程
可以与诱发突变相互补充，增加了变异的来源
无性系变异的缺点
变异是随机和不可预测的，畸变频率高
依赖于基因型
获得的变异并不总是稳定和遗传
并不是所有的变异都是有效的
影响变异来源及因素
变异来源
外置体细胞来源的突变
外植体突变细胞与正常细胞组成的嵌合体
先存在于分化的细胞中
离体培养诱导的突变
影响因素
外植体
植物的种类和基因型
外植体然色体倍数水平
外植体生理状态
不同培养器官的影响
培养基及培养方式
继代培养的次数
体细胞无性系变异的特征
普遍性
多样性
可遗传性
细胞突变体的鉴定
形态学鉴定
生物化学形状分析
细胞学分析
分子水平检测
细胞突变体的筛选与利用
富含氨基酸和氨基酸类似物细胞突变体筛选和利用
抗除草剂细胞突变体筛选和利用
抗逆细胞突变体筛选和利用
单倍体细胞突变体筛选和利用
植物细胞突变体筛选方法
正选择法
一步筛选法
利于筛选单基因控制细胞突变体
多步筛选法
利于筛选多基因控制细胞突变体
负选择法
“绿岛”法
体细胞无性系变异的应用
体细胞无性系变异与抗病育种
体细胞无性系变异与抗非生物胁迫
遗传研究
发育生物学研究
生化代谢途径研究
体细胞无性系变异的分类
染色体组型变异
由染色体重排造成的基因丢失
转座因子的激活，由转座引起突变
体细胞基因重排
基因的扩增和消减
体细胞姊妹染色单体的互换
现在病毒的淘汰
植物原生质体培养
植物原生质体分离
基因型与外植体的选择
一般而言，植物的各个器官及愈伤组织和悬浮培养细胞都可以作为分离原生质体的起始材料
分离植物原生质体的酶
纤维素酶
半纤维素酶
果胶酶
有些植物材料需要加入半纤维素酶
渗透压的稳定剂
原生质体的游离
材料的预处理
材料的灭菌处理
酶解处理
微原生质体的分离
原生质体的收集和纯化
最常用的方法是过滤和离心相结合
原生质体活力鉴定
一般采用FDA染色法
原生质体培养
原生质体培养基的选择
培养基种类的选择
培养基中渗透压稳定剂的选择和应用
培养基中的无机盐
培养基中的有机物和pH
培养基中的植物激素
植板密度
原生质体培养方法
固体培养法
液体培养法
固液结合培养法
念珠培养法
植物体细胞融合方法与杂种选择
方法
电融合法
聚乙二醇高钙高pH法
问题
杂交组合的选择
原生质体的制备
融合方法
选择杂种的方法
由杂种细胞诱导获得再生植株是否为杂种的鉴定方法
植物细胞融合的种类
常用的体细胞杂交
配子见细胞杂交
配子-体细胞杂交
原生质体再生植株
通过器官形成途径再生植株
原生质体培养基
分化培养基
生根培养基
通过胚状体发生途径再生植株
超低温贮藏技术
超低温保存的原理
超低温处理植物材料，可以使植物细胞和组织培养物内的物质代谢和生长活动大大减慢，甚至几乎完全停止
植物种质超低温保存成功的关键是要避免细胞和组织内结冰
通过添加高浓度的冷冻保护剂，可以显著降低形成玻璃化所需的降温速度
超低温保存的作用和意义
保持细胞培养物的遗传稳定性
植物种质资源的长期保存
农作物优良品种及亲本材料种质的长期保存
超低温保存后存货材料的评价
存活率的快速鉴定
细胞结构和遗传稳定性的鉴定
超低温保存的方法与技术
植物材料的选取
植物材料的预处理
加入冷冻保护剂
低温锻炼
冷冻方法
慢冻法
快冻法
玻璃化法
干冻法
包裹脱水法
包裹玻璃化法
冻藏
化冻与洗涤
再培养
植物悬浮细胞
人工种子包埋方法
水凝胶包埋法
液胶包埋法
干燥包埋法
植物悬浮细胞培养的基本方式
分批培养
特点
培养基体积固定
培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈S增长
必须适当搅拌
生长曲线
周期
滞后期
对数生长期
直线生长期
减缓期
静止期
继代方法
最佳继代时期
对数生长期和直线生长期
连续培养
分类
开放式培养
培养细胞数目保持恒定
封闭式连续培养
培养细胞数目不断增加
应用
次生物质的大量生产
植物悬浮细胞系的作用
细胞悬浮细胞系是原生质体培养与人工种子的研制奠定良好基础
为遗传转化提供了良好的受体
用于生产植物次生代谢产物
植物次生代谢产物
植物次声代谢产物分类
酚类化合物
含氮化合物
实现规模化生产的前提和关键
高产细胞系的筛选
培养基的优化
代谢调控
诱导子
培养方法
两步培养法
两相培养法
固定化培养
生物转化
建立良好悬浮细胞系的技术关键
选择适合的基因型和外植体
诱导疏松易碎的愈伤组织
选择适合的细胞悬浮培养基
培养基灭菌
细胞悬浮培养
悬浮细胞的继代与同步化
悬浮细胞的活力和生长速度
悬浮细胞愈伤组织的形成和植株再生
细胞生长量的计算
细胞计数
细胞体积
细胞鲜重
细胞干重
细胞活力的测定
荧光素双醋酸酯法
台盼蓝染色法
四唑盐（MTT）比色法
酚藏花红
人工种子
各部分功能
体细胞胚或不定芽等
在一定条件下都能萌发生长并形成完整植株
人工胚乳
提供营养物质
保护作用
分类
裸露的或休眠的繁殖体，可以直接播种
人工种皮包裹的繁殖体
水凝胶法包埋的体细胞胚，不定芽以及休眠的小鳞茎等繁殖体
液胶法包埋的繁殖体
人工种子的特点
可对一些自然条件下不结实的种子进行繁殖
固定杂种优势，大大缩短育种年限
节约粮食
可人为的控制作物生长发育和抗性
可以保存及快速繁育脱病毒苗
与试管苗相比成本低，运输方便
人工种子转换方法
无菌条件的转换
土壤条件下的转换
无土培养试验
土壤试验
储藏与萌发
低温储藏技术
液体石蜡储藏技术
超低温贮藏技术
干燥法
人工种子包埋方法
滴注法
装膜法
目前涉及的问题
高质量和数量体细胞胚的诱导
体细胞胚发生的同步控制
人工种皮的制造与生产
体细胞胚的诱导与同步化
人工种子的包埋
人工胚乳的制作
人工种皮的制作
人工胚乳的研制
工艺流程
贮藏