导图社区 流式细胞术(FCM)
流式细胞术的原理及应用,流式细胞术(FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
编辑于2023-07-24 10:41:05 四川省流式细胞术(FCM)
概念
流式细胞术(FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是:1.测量速度快,最快可在1秒种内计测数万个细胞;2.可进行多参数测量,可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量,并具有明显的统计学意义;3.是一门综合性的高科技方法,它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果;4.既是细胞分析技术,又是精确的分选技术。
流式细胞仪的分类及检测范围
分类
分析型流式细胞仪
细胞样本分析后最终进入废液桶,不能回收利用
分选型流式细胞仪
既能流式分析,还能对分析的目的细胞进行分选
检测范围
细胞结构
大小、颗粒度、表面积、核浆比例
DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白质含量
细胞功能
细胞特异性抗原
细胞活性、细胞因子、蛋白质磷酸化
PH、细胞膜电位
用途
检测细胞周期
检测细胞凋亡
检测细胞增殖
免疫细胞亚型检测
检测细胞因子
检测细胞吞噬功能
流式分选
光信号的类型
散射光信号:与标记荧光素无关,是细胞的固有参数
前向散射光FSC:FSC信号方向与激光束平行,偏离度一般在1-6°范围内,亦称小角度散射光,主要反映被测细胞的体积大小和活力
侧向散射光SSC:SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直,亦称90度散射光,其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化
作用
利用FSC和SSC这两种参数的组合,区分不同的细胞群体,去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰
通过FSC/SSC散点图,gate出目标细胞进行分析
荧光信号:1.自发荧光 (细胞色素因子、核黄素):微弱;2.特异荧光:标记的荧光素分子发出的荧光,比自发荧光强很多倍
常用荧光素
<499nm 蓝色荧光(Blue)
500-549nm,绿色荧光(Green)
550-584nm,黄色荧光(Yellow)
585-615nm,橙色荧光(Orange)
616-700nm,红色荧光(Red)
≥700nm,远红外荧光(Far-Red)
标记抗体的荧光素
FITC(异硫氰酸荧光素 490,520)
PE(藻红蛋白 488,575)
PerCP(多甲藻叶绿素蛋白 490,675)
APC(别藻青蛋白 650,660)
PE-Cy5(藻红蛋白-花青素5 496/546,670)
PE-Cy7(藻红蛋白-花青素7 496/546,767)
核酸荧光染料
PI(碘化丙啶 535, 623):可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析,需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响;PI不能透过活细胞膜,常用于鉴定死细胞
7-AAD(7-氨基放线菌素D 545, 647 ): 以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合,不能透过活细胞膜,常用于鉴定死细胞
DAPI(4,4,6-二脒基二苯基吲哚 358, 456):可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料,一种理想的DNA定量染料
Hoechst(343, 450):常见为Hoechst33342和Hoechst33258,非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色,用于活细胞DNA定量分析,如精子分选;还用于侧群细胞的分选
PY(派若宁 560, 573): RNA染料,能进入活细胞
AO(吖啶橙 509, 525): DNA、RNA染料,染色后DNA呈黄绿色荧光,RNA呈橙黄色荧光,可进行DNA/RNA双参数分析
流式细胞术的应用
检测细胞周期
DNA荧光染料能与DNA结合,DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比,荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量,区分细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例
检测细胞凋亡
亚二倍体(Sub-G1)峰的检测
凋亡细胞核小体崩解,DNA含量减少,加之由于DNA的降解,与荧光染料的结合减少,因此DNA染料的着色能力下降,荧光强度降低,表现在G1峰前出现亚二倍体峰,即亚G1峰(凋亡峰)
Annexin V/PI双染法
正常细胞膜是不对称性的,胞浆面含有带负电的磷脂(如磷脂酰丝氨酸, PS)。早期凋亡时,细胞表面不对称性发生改变,PS外翻到胞外侧。Annexin V是一种Ca2+依赖性的对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白,可作为探针识别膜表面是否有PS,从而识别凋亡细胞
线粒体膜电位检测法
凋亡细胞线粒体膜电位会发生改变,利用荧光探针罗丹明123(Rh123)、DiOC6和JC-1等标记后,经过流式能检测出线粒体电位的变化,从而反映了细胞的凋亡情况
DNA断裂片段的检测(TUNNEL法)
凋亡中晚期会发生核酸内切酶的激活,双链的DNA出现不对称的断裂点,即产生一系列3’-OH端。加入外源性的脱氧核苷酸末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)能够催化外源性荧光素标记的dUTP连接到DNA的3’-OH端,通过流式检测就能知道DNA断裂片段的多少,这种方法叫做TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TdT mediated-dUTP nick end labeling, TUNEL)
检测细胞增殖
示踪染料标记法
示踪染料能与细胞发生非特异性的稳定结合,标记细胞后对细胞没有很强毒性,被激发后能发出很强的荧光,并且非常稳定,只有当细胞分裂时,母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中,细胞的荧光信号减少一半
BrdU标记法
5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)是胸腺嘧啶核苷的类似物,在细胞增殖DNA合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的DNA中,而BrdU抗体可以特异性的识别BrdU,所以可以检测细胞增殖
检测细胞吞噬功能
把细菌或者吞噬颗粒标上荧光后,与目标细胞在37℃作用一段时间,流式细胞仪检测荧光信号的强弱就可以区分目标细胞是否具有吞噬功能以及吞噬功能的强弱
流式分选
免疫细胞亚群分选
临床应用
T细胞
细菌感染
T4细胞上升
T8细胞下降
T4/T8比值上升
病毒/胞内菌/寄生虫感染
T4细胞下降
T8细胞上升
T4/T8比值下降
晚期患者T4、T8、T细胞全线减少
B细胞
B1细胞上升:慢性B细胞白血病、自身免疫病
B2细胞上升:细菌性感染
NK细胞
NK细胞上升:各种感染早、中期
NK细胞下降:感染晚期
判断急性白血病
GFP阳性稳转株分选
干细胞分选
造血干细胞分选
肿瘤细胞分选
侧群细胞分选
流式细胞术操作与技巧
操作流程
单细胞悬液制备
新鲜实体组织的样本制备:对于不同组织来源的实体组织和实体瘤标本,应该根据各自特点选择不同的分散细胞方法,以期达到单细胞产量高、损伤小的目的
酶消化法
机械法:有剪碎法、网搓法、研磨法等,易造成细胞碎片和团块,实际操作时,应注意碎片和团块的去除,常与其他方法(如酶消化法)配合使用
化学处理法:将组织细胞间起黏着作用的钙、镁离子置换出来,从而使细胞分散开来,常用试剂有EDTA、EGTA、TPB等
石蜡包埋组织样本制备
血液、骨髓样本制备
Ficoll密度梯度离心法分离PBMC
红细胞裂解液去除红细胞
培养细胞单细胞悬液制备
体液脱落细胞样本制备
免疫荧光染色
免疫荧光染色主要包括直接和间接免疫荧光染色两种方法。间接标记的方法难以进行多色标记,而且操作复杂、信噪比高,所以一般首先直标荧光抗体
上机检测
对照设置
空白对照
细胞内物质自身也发出荧光,能被FCM灵敏的检测到,这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光,设置空白对照(未染色细胞胞),用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光,避免假阳性的结果
阳性对照
设置阳性对照是为了检测荧光抗体是否有效,并不是每次分析时都必须设置
使用新的荧光素抗体时
使用存储时间较长的荧光素抗体时
单标对照
两色或多色实验时须设置单标对照,用于补偿的调节
光谱重叠与补偿
当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时,理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质,虽然它们之间各自发射的峰值各不相同,但发射谱范围有一定的重叠,因而少量的荧光信号会被另一通道检测到,这种现象就是光谱重叠(spectral overlap)
实验操作中,常利用电子技术和计算机软件设置的方法将串入相邻荧光通道的信号扣除,这种技术称为荧光补偿(fluorescence compensation)
流式细胞仪的结构组成
液流系统
流动室
液流驱动系统
鞘液(sheath)
鞘流技术:根据层流原理发展起来的技术,可以实现两种液体的同轴流动,样本细胞流位于轴心稳定流动,外面包裹有鞘液(sheath)
样本流(sample)
流体动力学聚焦:稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后,有一个聚焦收缩作用,细胞流直径被约束在10-20um,避免了多个细胞重叠进入检测区
光学系统
激发光源:激光器
气体激光器:氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子(647nm)、氪氩(568nm)
染料激光器:如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激光器,发出550-650nm可变波长激发光
半导体激光器:价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器
激光特点:单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照
光收集系统
滤光片的组成
长通滤片LP:允许某特定波长以上的光通过
短通滤片SP:允许某特定波长以下的光通过
带通滤片BP:只允许相当窄的一个范围波长的光通过
全反射光路
电子系统
光电检测器:将光信号转换成电子信号
光电二极管(photodiode):光灵敏度低,测定强信号(FSC)
光电倍增管(photomultiplier, PMT):光灵敏度高,测定弱信号(SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)
前置放大电路:将信号等比例放大,输出电脉冲信号
线性放大
对数放大
一般FSC和SSC变异范围较小,故使用线性放大;荧光信号变异范围较大,多使用对数放大
模数转换器:将模拟的电脉冲信号转换成数字信号
数据处理系统:计算机系统数据采集、分析
数据显示
直方图:细胞的某一单参数数据的统计分布图,横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值,单位是道数,纵坐标一般是细胞数
横坐标既可以是线性的也可以是对数的
散点图:散点图中每个点代表一个细胞,X轴与Y轴分别代表一种参数,优点是比直方图直观
等高线图:类似于地图中的等高线,同一条线上的细胞数目相等,越在里面的曲线代表细胞数目越多
密度图:点密度越大的地方细胞越多,点密度越小的地方细胞少
三维图
设门与数据分析
门(Gate,简写G)是流式细胞术中的一个重要术语,FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程
R(Region,区域)。门可以是单一区域(G=R1),也可以是几个区域组合在一起
示例:
流式分选系统
当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时,流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时,依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转,落入指定的收集器内
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