蛋白质纯化

利用溶解度、分子大小、所带电荷、相互作用分离。等电点沉淀、盐溶盐析、有机溶剂沉淀、加热沉淀、凝胶过滤层析、凝胶电泳……纯化流程，评估，具体技术

蛋白质纯化

• 技术
  • 溶解性差异
    • 等电点沉淀
      • 蛋白质在等电点处溶解度相对最低，通过调节PH达到PI
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    • 盐溶/盐析
      • 蛋白质中加入离子，促使蛋白质形成双电层增加溶解度；后盐离子吸附完溶液水后吸附蛋白质水化层的水，蛋白质疏水区暴露、聚集，溶解度降低
      • 对盐要求：有足够大溶解性；对蛋白质无毒性 如硫酸铵（硫铵沉淀法）
    • 有机试剂沉淀
      • 作用
        • ①降低溶液介电系数，静电相互作用上升，增加蛋白质分子之间吸引力，趋向聚集沉淀
        • ②加入的有机溶剂一般会吸引水分子，破坏水化层
      • 同一试剂对于不同蛋白质沉淀程度不同
      • 易使变性，要在低温操作，并且目标蛋白沉淀后尽快离心弃去有机溶剂
    • 加热沉淀
      • 有些蛋白质加热失活，沉淀；有些则保持活性。从而沉淀掉热不稳定的杂蛋白
  • 分子大小
    • 凝胶过滤层析
      • 也叫分子筛层析，小分子蛋白能进入介质小球，路径长后流出，大的先出。紫外监测仪
      • 经验公式可根据洗脱体积Ve得到蛋白质分子大小范围
      • 分配系数Kd越大越易分离；洗脱曲线，洗脱体积（每种蛋白质不同）
      • 缓冲溶液中常含0.15mol/LNaCl溶液，防止蛋白质与层析介质的静电相互作用
    • 凝胶电泳
      • 常为SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳；微量操作，主要用于蛋白质分子鉴定、可知大致分子量
      • 迁移率：单位电压下的移动速率，与所带电荷成正比，摩擦系数（大小、形状有关）反比
      • 试剂
        • 变性剂SDS：有许多疏水基团可与蛋白质疏水区结合，所带负电可屏蔽蛋白质电荷
        • 加速剂TEMED：加速凝胶聚合
        • 染色
          • 考马斯亮蓝（染大量）；硝酸银染色（银染，染微量）
    • 细分离
    • 密度梯度离心
      • 利用密度差离心；其他影响因素：分子大小、体积大小、粘稠度-->总衡量量：沉降系数
      • 分类
        • 沉降速度法
          • 用于沉降系数相差较大的
          • 采用差速离心，逐级增大离心力，反复多次使物质按不同沉降系数逐级分开
        • 沉淀平衡法
          • 用于沉降系数相差较小的
          • 在离心管中制造离心梯度，下面密度大上面小，最后成分分别停留在与自身密度相同的介质处（需要足够时间）
    • 膜分离技术
      • 透析
        • 透析袋孔径一定，小分子可以透过，大分子不能透过
      • 反透析
        • 利用高分子量吸水剂（如聚乙二醇）放在透析袋外，水分子渗出，可用于蛋白质浓缩
      • 超过滤
        • 类似于透析，但孔径更严格，可把不同大小蛋白质分开
  • 所带电荷
    • 离子交换层析（细分级）
      • 类似于凝胶过滤层析，但层析介质带电荷，利用待分离物质与层析介质之间的静电相互作用，不同物质吸附能力不同
      • 分类
        • 阳离子交换层析
          • 阳离子交换树脂，待分离为正电荷，在进行二次交换、逐渐洗脱
            • 逐渐改变离子强度或PH
        • 阴离子交换层析
      • 不清楚目标蛋白PI时条件摸索
        • PH值
          • 准备一系列PH不同加入介质的试管，看蛋白质吸附介质沉淀还是在上清液，从而确定什么样的PH适合蛋白质吸附（等电点）
        • 离子强度
          • 太强则介电常数大，相互作用小，难吸附
        • 吸附载量
          • 逐渐增加蛋白质看什么时候上清液开始有蛋白质
    • 等电聚焦电泳
      • 凝胶通电形成PH梯度，加入蛋白质后会停留在等于PI的PH处
      • 主要用于鉴定
  • 与其他化合物的相互作用
    • 亲和层析
      • 介质与底物专一性相互作用；高效但不适于工业生产
      • 金属螯合层析
        • His与金属离子特殊吸引作用，基因工程表达蛋白质末端加上连续his（前有酶切位点）从而被吸引分离。高效，可直接越过粗分级
    • 吸附
      • 某些物质对蛋白质吸附，但非专一性，如 羟基磷灰石，属于粗分级
    • 疏水作用层析
      • 疏水分子作为介质，通过疏水作用与蛋白质相互作用。高盐吸附，低盐洗脱，与离子交换相反
• 评估
  • 电泳条带、HPLC高效液相层析的峰个数
  • 总蛋白，总活力，比活力，纯化倍数，回收率
• 流程
  • 原理
    • 利用目标蛋白与其他物质的差异来纯化
  • 原则
    • 尽可能少的步骤（越多损失越多），尽可能短的时间（考虑活性）
  • 步骤
    • 前处理
      • 要知道目标蛋白在哪，对材料处理，使目标蛋白进入溶液
      • 方法
        • 物理法
          • 超声波（要间歇，因为太弱无效果，太强破坏蛋白质）
          • 研磨
          • 冻融法
            • 用于细胞壁较脆弱的菌体或动物细胞（无壁，脆弱）
        • 化学破碎法
          • 采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分，常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂
        • 酶裂解法
          • 溶菌酶破坏细胞壁，完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性
    • 初分离
    • 细分离
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