临床免疫学、仪器学流式细胞仪FCM

广州医科大学临床免疫学检验、临床仪器学的流式细胞一章相关笔记，仅供参考。

流式细胞仪FCM

• 概念：同时检测快速直线流动状态中的单个细胞/生物学颗粒的多项物理及生物学特性。
• 技术涉及：激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术
• 特点
  • 检测速度快，分析样本量大
  • 可以同时分析单个细胞的多种特征
  • 可以检测的样本种类多
• 检测范围
  • 细胞结构
    • 大小、颗粒度、表面积、核浆比例
    • DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白质含量
  • 细胞功能
    • 细胞特异性抗原
    • 细胞活性、细胞因子、蛋白质磷酸化
    • PH、细胞膜电位
• 用途
  • 细胞表型分析
  • 细胞生物学研究
  • 纳米药物和材料研究和应用
• 基本组成和原理
  • 原理
  • 流路
    • 流动室
    • 鞘液SHEATH
      • 流体动力学聚焦
    • 样本流SAMPLE
    • 液流驱动系统
  • 光路
    • 光源
      • 激光
    • 滤片——二向色滤片
      • 长通滤片LP：允许某特定波长以上的光通过
      • 短通滤片SP：允许某特定波长以下的光通过
      • 带通滤片BP：只允许相当窄的一个范围波长的光通过
    • 光电倍增管PMT HV
    • 仪器
      • 成形：透镜聚焦
      • 收集
        • FCM散射光测量（细胞）
          • 前脚散射光信号FSC（与激光束方向同轴）——强度与细胞体积呈正相关
          • 侧角散射光信号SSC（与激光束垂直）——强度与细胞器、颗粒的多少呈正相关
        • FCM荧光测量
          • 荧光信号问题
            • 参数应用
            • 光谱重叠——解决：荧光补偿（单染实验）
            • 抗原抗体结合非特异性因素——解决：建立对照试验
          • 多色分析——荧光标记单克隆抗体染色
          • 荧光信号强弱反映细胞抗原的表达含量
          • 选择正确的激光器：确定正确的滤光片；确定所需荧光探测器（PMT）
  • 电路
    • 放大电路HV、GAIN 增益
    • A/D转换
    • 功能
      • 电脉冲信号产生：PMT(光电倍增管）将光信号转变为电脉冲信号
      • 光电检测：放大器
        • 信号强弱差<10倍or需线性关系：使用线性放大器（如散射光，DNA分析）
        • 信号强弱差>10倍or需分析弱荧光：使用对数放大器
      • 数据储存
      • 数据显示
        • 直方图
        • 二维点图
        • 等高线图
        • 密度图
        • 三维图
  • 统计
    • 结果解读
      • 百分比——目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例
      • 绝对浓度一目标细胞在样本中的浓度（cells/u)
      • 荧光强度一一单个目标细胞上表达某一个蛋白的多少
      • 变异系数一所有目标细胞表达某一个蛋白的离散程度
  • 细胞分选：当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。
• 性能指标
  • 灵敏度
    • 荧光灵敏度
    • 前向角散射光检测灵敏度
  • 分辨率
  • 分析速度
    • 死时间：以每秒分析的细胞数来表示。当细胞流过的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会丢失的这段时间
  • 分选指标
• 质量控制
  • 光路与流路的校正
  • PMT校正
  • 绝对计数校正
• 临床应用
  • 免疫感染
    • Tcell
      • 细菌感染
        • T4细胞上升
        • T8细胞下降
        • T4/T8比值上升
      • 病毒/胞内菌/寄生虫感染
        • T4细胞下降
        • T8细胞上升
        • T4/T8比值下降
      • 晚期患者T4、T8、T细胞全线减少
    • 
  • 肿瘤
  • 血液