蛋白质测序

关于蛋白质测序的内容，如水解、切割、测序方法、二硫键断裂与位置确定等。

蛋白质测序

• 蛋白质水解
  • 完全水解
    • 酸水解（硫酸，6mol/L盐酸） 缺点：色氨酸被破坏，酰胺水解成羧酸
  • 不完全水解
    • 碱水解 色氨酸不被破坏，其他都会有部分破坏
    • 蛋白酶水解
• 两端测序方法
  • N端
    • FDNB法（2,4-二硝基氟苯），DNS法（丹磺酰氯法），PITC法（异硫氰酸苯酯）；
    • 氨肽酶法：氨肽酶是一种外肽酶，N端开始降解，但对于不同氨基酸时间不同，不准确
  • C端
    • 羧肽酶法——羧肽酶A水解除了P/R/K的所有氨基酸（但第二个不能是Pro）；B只能水解R/K（第二个不能为Pro）；C只在第二个为Pro切割；Y切割所有。
    • 肼解法与还原法不常用，分别用肼、NaBH4反应
• 肽链切割
  • 蛋白酶切割
    • 胰蛋白酶：专一性强，只在Arg、Lys的C端切割
    • 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：较强，在三种芳香族氨基酸C端切割
  • 化学试剂切割
    • CNBr：在Met的C端切割（一般甲硫氨酸在肽链中出现较少）
    • 羟胺：需识别肽链两端，不常用
• 测序
  • Edman降解法：PITC异硫氰酸苯酯加到N末端，得到PTC-肽不稳定，在CF3COOH无水条件下N端前两个肽断开，与PITC连接的分离后鉴定；继续下一轮，以此类推。 由于损耗只能测有限肽数。
  • 固相测序：将C端用共价键连接到固相，Edman讲解后C端进入液相，易分离，回收率高
  • PITC用荧光/化学发光基团标记 可提高灵敏度
• 二硫键
  • 断裂
    • 氧化法：过甲酸，得到磺酸基团
    • 还原法：DDT二硫苏糖醇或巯基乙醇（需保护巯基，如酰基化/碘化）
  • 位置确定
    • 对角线电泳法：胃蛋白酶水解得肽段，酸性，二硫键稳定；电泳，用过甲酸蒸汽熏蒸，破坏二硫键；滤纸旋转90°电泳，含-SH的两个肽段偏离
• 氨基酸分离
  • 离子交换层析
    • 一般用强阳性；氨基酸自动分析仪可分离、测定各氨基酸含量（茚三酮显色，分光光度测量）
  • HPLC高效液相色谱（常用疏水层析，不易变性）
  • 分配层析
    • 分类：分配柱层析、纸层析、薄层层析、气相色谱。
      • 纸层析：滤纸为固定相，有水、亲水性比较强（因而疏水走的更远），根据相对迁移率可定性分析种类。
      • 薄层层析：在玻璃板上加不同东西，可改变固定相，用法更宽
      • 气相色谱：流动相为气体，用于分离气体，固定相为液相
• 流程
  • ①肽链的数目：通过SDS-PAGE 若出现多条带->杂多聚，一条带且与蛋白质分子质量一定->单体蛋白，否则可能是同多聚/杂多聚（亚基大小差不多）
  • ②若肽链数＞1，拆开，并断开二硫键
  • ③测定每一条肽链序列（长肽还要强专一性切割、比较），并测定N、C端
  • ④Edman测序（较少的用MS也行），并拼接，有二硫键还要确定二硫键位置