导图社区 细胞工程
这是一篇关于细胞工程的思维导图，包含研究范畴、应用、细胞培养、细胞融合技术等。
这是一篇关于酶工程的思维导图，包含酶分子修饰、酶固定化、在食品工业中的应用等。
这是一篇关于蛋白质工程的思维导图，干货满满，感兴趣的小伙伴可以参考使用！
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细胞工程
概念
利用 细胞生物学&分子生物学技术 ， 应用 工程学 的方法，在 细胞水平 上研究改造 生物遗传特性&生物学特性，从而获得特定の细胞、细胞产品or新生物品种 的一门综合性科学技术。
研究范畴
动物细胞与组织培养
植物细胞与组织培养
细胞融合（体细胞杂交）
单克隆抗体
细胞核移植（细胞拆合）
染色体工程
动物
植物
胚胎工程
干细胞与组织工程
细胞生物反应器
应用
植物细胞工程
种苗脱毒&快速繁殖
脱毒：脱去病毒，不是脱去毒素
基础研究
体细胞杂交
体细胞融合产生远缘杂种
植物特殊倍性创造
多倍体
三倍体培养
胚乳培养
单倍体
花药培养
花粉培养
次生产物生产
培育植物新品种
动物细胞工程
疫苗生产
乙型肝炎表面抗原基因→插入 哺乳动物细胞→高效表达→乙型肝炎疫苗
生产单克隆抗体
检测出多种病毒中非常细微的株间差异→鉴定细菌的种型&亚种
繁育优良品种
人工受精、胚胎移植等技术→畜牧业生产
干扰素生产
细胞培养
动物、植物&微生物 细胞→体外 无菌→生长、分裂&繁殖，并 在培养过程中不再形成组织。
植物细胞培养
发展
细胞学说
施莱登&施旺
植物受伤愈合组织の皮层能产生芽
细胞全能性学说
一般步骤
取材&除菌
消毒酶菌剂：次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞……
配置培养基→灭菌/除菌→无菌操作→将生物材料接种于培养基中
培养基放入培养箱→提供各类细胞生长所需の最佳培养条件→细胞达到一定量，及时收获/传代
培养基
通常包括：无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂……
碳源和能源
蔗糖 & 葡萄糖。
维生素
硫胺素（培养中的植物细胞都需要）
烟酸、泛酸、生物素、叶酸
氨基酸
L-谷氨酰胺、蛋白酶解产物。
植物生长激素
生长素
吲哚乙酸 & 萘乙酸
分裂素
6-苄氨基腺嘌呤 & 玉米素
外植体
植物组织培养：离体培养 の 植物材料。
愈伤组织
外植体 → 组织增生の细胞 → 一团 不定型の 疏散排列の 薄壁细胞，是分化的 & 未形成组织 の 结构。
诱导
选择适宜的 外植体
幼胚、下胚轴、子叶
选择适宜的 培养基 （MS、B5、N6）
较高の激素浓度
丰富の有机附加物
较高含量の无机氮源
较低の蔗糖浓度
适当 缩短 继代培养 の 间隔时间
有利于疏松易碎愈伤组织的形成。
悬浮培养
适宜悬浮培养の要求
松散性好、增殖快、再生能力强.
外观一般is色泽呈鲜艳の乳白/淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎.
VS 适宜 再生植株
绿色
高表达细胞系の筛选建立
悬浮培养物 分散性好、外观疏松、色泽鲜艳
均一性好
生长速度快、次生代谢产物合成能力强
单细胞培养技术
单细胞 分离方法
机械法
研碎→过滤&离心→收集&净化
优点：不受酶的伤害，利于细胞生理&生化研究。
缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少
酶法
果胶酶、纤维素酶
+渗透压保护剂：甘露醇→以防酶对细胞的损伤
+硫酸葡聚糖钾盐→提高游离细胞的产量
化学法
草酸钙→胡萝卜悬浮细胞培养
秋水碱、2，4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）/ LH（促黄体生成素）
单细胞 培养方法
看护培养
一块 活跃生长の愈伤组织 → 促进 培养细胞 持续 分裂&增殖
优缺点
优点：简单易行、效果好
缺点：不能在 显微镜 下 追踪细胞分裂、生长 过程。
平板培养
悬浮单细胞&融化的琼脂培养基→混合→平铺一薄层在培养皿底上

优点：
分布均匀→便于 显微镜：细胞 定点观察
筛选效率高、筛选量大、操作简便
缺点：通气状况不好，排泄物质易积累→毒害/影响组织吸收。
微室培养
人工制造 无菌小室 ： 一滴悬浮细胞液 → 培养在少量培养基上→分裂增殖→细胞团
优点：可对培养细胞 连续进行显微观察→了解一个细胞の生长、分裂、分化等过程。
缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
植物细胞の 保存
继代培养 保存方法
低温 保存方法（5-10℃）
超低温 保存方法
植物细胞 大规模培养
在食品工业中的应用
利用植物细胞工程 生产香料
生产 食品添加剂
生产 天然食品
特点
植物细胞对剪切力敏感。
植物细胞培养通常形成细胞团。
植物细胞生长速度慢，操作周期长
多泡沫。
植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。
植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。
大多数植物细胞培养需要光照。
把 离体の植物细胞 悬浮在 液体培养基 中进行 增殖培养。
生物反应器
机械搅拌反应器
优点
最大优点：高的溶氧量
较易控制：温度、pH、溶氧、营养物质
缺点
剪切力问题
单位体积消耗的功率 比 气体搅拌 大
搅拌轴→无菌密封
非机械搅拌反应器 常为：气体搅拌器
气升式反应器
外循环式
内循环式
鼓泡式反应器
剪切力小
易保持无菌
操作费用低
高度密封培养时→混合不够均匀
过量 通气→易排除 培养液中の CO2 & 乙烯
过高 溶氧→不利于 合成 次级代谢产物
优势
1)培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。
2)可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部浓度过高的问题。
3)能充分保证氧的供给。
固定化培养
将植物细胞→包裹：一些多糖/多聚化合物→培养 & 生产有用代谢物。
填充床反应器
流化床反应器
膜反应器
(1)有利于次生物质的合成、积累；
(2)减弱剪切力损伤；
(3)有利于连续培养&产物收集。
动物细胞培养
动物机体→取出相关组织→分散→单个细胞→适宜培养基→生长增殖&维持功能和结构。
原代培养
动物组织消化后の初次培养。
传代培养
胰蛋白酶→接触抑制の贴壁细胞→培养瓶壁上 脱离 → 细胞悬液 → 分装→多个培养瓶中→继续培养の过程。
细胞系
初次培养の细胞 经 第一次传代成功后。
细胞株
从一个经过生物学鉴定の细胞系→用 单细胞分离培养 or 通过筛选 方法，由单细胞增殖 形成の细胞群。
有限细胞系
在体外的 生存期有限，即 不能 长期传代 の细胞系。
无限细胞系
在体外 可以 持续生存，具有 无限繁殖能力 の细胞系。
生长特点
贴附生长
粘附型细胞
附着在 某一固相支持物表面 才能 生长の细胞。
绝大多数有机体细胞
悬浮型细胞
不必附着于 固相支持物表面，悬浮状态下 即可 生长の细胞。
肿瘤细胞、白细胞
接触抑制
细胞：贴壁生长→细胞间 相互接触→细胞 分裂&生长 停止 の现象。
肿瘤细胞：无
密度抑制
细胞密度增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多→营养枯竭&代谢物の影响→细胞分裂&生长停止
形态
类型
上皮细胞型
类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。
彼此紧密相连 成 铺石状薄层；生长时呈 膜状移动；很少脱离细胞群 而 单个活动。
成纤维细胞型
胞体梭形or不规则三角形；胞质向外伸出2—3个长短不等的细胞突起；中有卵圆形核。
排列成 放射状，漩涡状，不连成片。
游走细胞型
外形不规则且不断变化，细胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。
生长位置 不固定，分散，呈 活跃の游走&变形运动。
多型性细胞型
外形不规则，细胞由略呈多角形的胞体和细长的、类似伪足的胞突两部分组成，胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。
变化の影响因素
血清
pH
细胞密度
生长状态改变
转化与否
培养细胞の生长&增殖过程
生命期
细胞在 培养基中 持续增殖&生长の时间。
包括
衰退期
一代生存期-生长曲线
”一代“：从细胞接种到分离再培养的一段时间。
潜伏期
指数增长期
平衡期
基本技术
无菌、无毒的环境
添加一定量的抗生素，定期更换培养液。
温度和pH
温度与体内相近 35-37℃
pH 7.2~7.4 。
气体环境
O2（细胞代谢所需）
CO2（维持pH）
CO2培养箱（95%O2+5%CO2）
营养成分
糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、激素以及动物or人血清……
平衡盐溶液BSS
人工合成培养基的基础用液
用来 洗涤细胞。
动物细胞 大规模培养
方式
分批式
流加式
半连续式
连续式
技术
贴壁培养
微载体培养技术
大载体培养技术
多孔载体培养
微囊化培养技术
中空纤维细胞培养技术
细胞融合技术
外力作用 → 两个以上の异源(种、属)细胞or原生质体 → 互相接触 → 不经 有性过程 → 膜融合、胞质融合&核融合 → 形杂合细胞 の现象。
过程
细胞→促融因子→凝集现象→质膜粘连→细胞质融合→核融合→杂种细胞。
诱导方法
病毒诱导细胞融合
仙台病毒、新城鸡瘟病毒、孢疹病毒……
最早采用の融合剂：病毒
常用于：诱导 动物细胞融合
需先用 紫外线 or β-丙内酯 灭活。
机制：病毒黏结作用
融合率较高，适合各种动物细胞
易培养
仙台病毒 不稳定
制备过程较繁琐
病毒引进细胞后Maybe 干扰 细胞の生命活动
化学融合剂法
聚乙二醇（PEG）诱导法
机制：改变 各类细胞の膜结构→两细胞相互接触部位の膜脂双层中脂类分子发生疏散&重组
使用方便
融合频率较高
有一定毒性
卵细胞 不适用
NaNO3 处理诱发融合
机制：Na+造成膜电位改变
缺陷：融合率低；对来源叶肉的高度液泡化的原生质体有害。
高pH-高浓度钙离子 处理
烟草叶肉原生质体
电诱导细胞融合法
原理：极化成偶极子
步骤
① 电泳
② 融合
融合率高
可显微镜下定向诱导细胞融合
可直接挑选杂种细胞
重复性强、对原生质体伤害小
装置精巧、方便简单
免去PEG诱导后的洗涤过程
诱导过程可控性强
必须购置专用の细胞电融合设备
激光诱导细胞融合
光镊の原理
均匀电场
非均匀电场
光镊 牵拉、辅助
离子束诱导细胞融合
细胞表面被刻蚀 → 通透性&跨膜电场 改变
原生质体
特殊方法→去除 细胞壁→裸露的、有生命力の 原生质团。
制备
取材与消毒
取材
可用 各种组织&器官，但多应用 叶片、愈伤组织 & 悬浮细胞；以及 茎尖根尖、子叶 & 胚性组织。
消毒
肥皂水—70%酒精—3%次氯酸钠—无菌水。
原生质体の分离
机械 分离法
高渗糖溶液：预处理→轻微质壁分离→收缩成球形→机械法磨研组织→伤口释放：完整的原生质体
优点：可避免酶制剂对原生质体的破坏
缺点：完整原生质体の数量较少
酶解 分离法
等渗酶液：降解细胞壁→保温一定时间
优点：获得量大，适用广泛
缺点：影响原生质体の活力
原生质体の纯化
漂浮法
优点：可避免分离の原生质体 因震荡 被组织碎片撞击 而 破损；所用药品简单，成本低。
缺点：对 离心力要求 比较严格；掌握不好，原生质体则 不易漂浮。
沉降法（过滤-离心法）
优点：简单
缺点：引起破碎
不连续梯度法
两种密度不同の溶液→形成不连续梯度→离心→原生质体&破损细胞→不同液相。
优点：可获数量较大の纯净原生质体；同时避免收集过程中原生质体质体带因相互挤压而 破碎。
洗涤
原生质体培养液
鉴定
低渗溶液
活力测定
形态识别
荧光显微镜识别法（FDA法）
FAD不发荧光，不具极性，能自由穿过细胞质膜；被活细胞の内酯酶水解→荧光素（不能自由穿越质膜）。
√ 活细胞：发荧光
酚藏花红染色法
√ 无活力の原生质体：红色
伊凡蓝染色法
√ 死细胞 & 有活力但受损：染色
融合子の鉴别
显微鉴定
根据 两亲本 原生质体の 形状&结构 の差异 →鉴别杂合体。
如：基本无色+绿色→白绿色：杂合细胞。
荧光标记
根据 可见标记性状 の 机械选择法。
FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色，
RITC(异硫氰酸罗丹明)在荧光显徽镜下呈红色
互补选择法
利用 两个亲本 具有 不同の遗传&生理特性→特定培养条件→只有发生 互补作用の杂种细胞 才能生长。
代谢互补
利用 两种营养缺陷型/两种抗性突变体 の 原生质体 进行融合，在 同时缺陷两种物质/同时含有两种有害物质の培养基上 筛选 杂种细胞，能生长の细胞团 可以初步认为由 杂种细胞 形成。
生长互补
双亲原生质体の生长 需要 外源生长激素，而 由双亲原生质体融合后 形成 对生长激素自养の杂种细胞，能在 无外源生长激素の培养基上 生长。
细胞拆合技术
胞质体
除去 细胞核 后 由膜包裹の无核细胞。由细胞松弛素B处理后经离心得到。
核质体
由 胞质体 分离出来の核，带有 少量胞质 并 围有质膜の结构。
微细胞
核内 染色体 不完整の细胞。
细胞重组
细胞融合技术&细胞核质分离技术→结合→融合介质作用→胞质体&完整细胞 / 胞质体&核质体 / 微细胞&完整细胞→重新构成细胞の过程。
三种方式
胞质体+完整细胞→细胞质杂交细胞
微细胞+完整细胞→微细胞异核体
胞质体+核质体→重组细胞
细胞拆合
完整细胞の细胞核&细胞质→特殊方法（紫外线：杀死核/吸取出核）分离→同种/异种の细胞核&细胞质→重新组合→培育新的 细胞/生物个体。
方法
物理 拆合法
机械方法or短波光
化学 拆合法
细胞松弛素
核移植技术
利用 显微操作技术 将一个细胞の细胞核 移植到 另一个细胞中，或者 将两个细胞の细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能 创造 无性杂交 生物新品种の一项技术。
