导图社区 蛋白质工程
这是一篇关于蛋白质工程的思维导图，干货满满，感兴趣的小伙伴可以参考使用！
这是一篇关于酶工程的思维导图，包含酶分子修饰、酶固定化、在食品工业中的应用等。
这是一篇关于细胞工程的思维导图，包含研究范畴、应用、细胞培养、细胞融合技术等。
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第14章DNA的生物合成读书笔记
蛋白质工程
蛋白质
生理功能
催化功能
酶
调节功能
激素
结构功能
细胞骨架
运输功能
血红蛋白
免疫功能
免疫球蛋白
运动功能
鞭毛、肌肉蛋白
储藏功能
酪蛋白
生物膜功能及神经传导等
人类生活中的の重要性
维持生命所必须の基本物质。
用蛋白质 诊断&治疗某些疾病。
食品工业应用蛋白质 制造各种产品。
实际应用の局限
发挥功能 要在：生理条件下
概念
对 现有蛋白的分子结构 or 对编码蛋白质的基因 → 改造or全新设计 蛋白质→ 获得适合人类需要的新型蛋白质产品。
食物蛋白质改性技术
蛋白质の功能特性
水合特性
溶解性
分散性
溶胀性
增稠性
乳化特性
乳化性
发泡性
持水性
持油性
流变&质构性能
胶凝性
黏附性
弹性
化学、物理、生物(酶) 手段 → 本质上改变蛋白质の功能特性→食品所需的品质特性。
方法
化学 改性
针对：氨基、羟基、巯基&羧基→化学修饰→改变蛋白质の结构、静电荷、疏水基团→改变基功能性质。
酶法 改性
酶法 水解 改性
蛋白酶→降解：食物蛋白→改善：溶解性、分散性、乳化性。
酶法 聚合 改性
转谷酰胺酶→蛋白：聚合改性→提高食物蛋白の功能性质。
物理 改性
各种物理场效应→改变蛋白质の功能特性。
如
组织化挤压改性
高压静电改性
高热高压改性
超声改性
高频电场改性
微波改性
……
技术手段
蛋白质水平
酶法水解or聚合 改性
改造 现有蛋白
基因水平
理性分子设计&定位突变
理性分子设计
在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建新的蛋白质分子。
基本步骤
分离纯化 目的蛋白，使之结晶，了解其 空间结构 尽可能多的信息。
确定 它の功能域。
分析 结构&功能 之间の相互关系，找出 关键の结构&基团。
围绕这些关键の基团&结构→提出对蛋白质进行改造の方案 & 用 基因工程の方法(定位突变)→实施。
对 经过改造の蛋白质 → 功能性测定、定位突变。
定位突变
按 理性分子设计の方案 → 已知编码蛋白のDNA序列 → 取代、插入or删除：选定の核苷酸。
常用技术
寡核苷酸引物介导の定位突变
原理
含 突变碱基の寡核苷酸片段→引物 →聚合酶 作用→启动DNA分子→复制
包括
Kunkel突变法
基于 抗生素の“抗性恢复”突变法
基于 去除 特定限制酶切点 の突变法
优缺点
优点
保真度比重组PCR突变法高
缺点
操作环节复杂，周期长
克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制
PCR介导の定位突变
PCR→插入&缺失の突变碱基→引物→两对引物→核酸：PCR扩增→重叠延伸→有部分重叠序列の两个PCR产物→混合、变性、复性和链延伸→一对与 两个待接片段 外侧互补 の引物→第二次扩增→全长の异源杂合双链DNA。
操作简单
突变成率100%
保真率偏低
后续工作复杂
盒式突变
又称：片段取代法
目标基因序列：适当 限制酶切位点→插入：各种合适の突变DNA片段→取代：目标基因中特定DNA片段。
盒式取代诱变
混合寡核苷酸诱变
简单易行
突变效率高
次改变多个位点或一个片段
合成DNA片段成本高
要求合适的限制内切酶位点
应用：酶结构 改造
增强 稳定性↑
提高 酶活力↑
改变 酶の选择性
消除 酶の抗氧化性
引入 二硫键
转化 氨基酸残基
改善蛋白质の热稳定性
改变 酶の最适合pH值条件
盒式突变→葡萄糖异构酶分子
修饰 酶の催化特异性
定点突变技术→葡萄糖淀粉酶
体外定向进化
非理性分子设计
理论来源
利用基因工程原理→实验室：模拟生物进化过程。
蛋白质の体外定向进化：又称 分子进化，
就是：实验室条件 → 模拟自然进化机制：对编码蛋白子の基因 → 诱变、重组 → 高通量筛选 → 选择出性能更加优良的蛋白质。
不需：已知蛋白质的结构信息
随机突变+定向选择=目标突变体
Vs 自然进化
进化动力不同
进化方向不同
进化速度不同
VS
定向进化
突变位点：随机、不确定，& 数目：不确定
突变效应：不可预知
定点进化
突变位点：确定，& 个数：预知
突变效应：可能是已知的
随机突变体の获得方法 （常用の定向进化技术）
重组
DNA 改组
一群密切相关的DNA序列→ DNaseI→随机酶切→许多片段→部分重叠碱基序列→自身引导PCR重组→全长基因→多样性文库→筛选突变文库→改良的突变体→下一轮模板→重复多次 重排&筛选→获得性状满意の突变体
外显子 改组
随机体外引发 改组
合成 改组
突变
容错PCR
Taq聚合酶→目的基因のPCR扩增，同时 引入碱基 错配→目的基因 随机突变
随机定位突变
交错延伸
应用：酶制剂 改造
L-天冬氨酸酶：提高酶耐热性&酶活
磷脂酶A1突变体：耐有机溶液
乙内酰脲酶：D-型底物 突变成 L-型底物
融合蛋白技术
有目的 → 把 两段/多段 编码功能蛋白の基因编码区 → 首尾连接 在一起 → 同一调控序列：控制 所构成の基因表达产物→表达所需の蛋白。
PCR介导の蛋白质分子嵌合体的形成
内含子介导の蛋白质分子嵌合体的形成
连接酶直接连接
应用
双功能酶
保留 所构成的酶分子各自の酶活性
可产生：“邻近效应”
靶向药物/定向药物
组成
药物
可与病灶特异性结合の配基
可构成：具有 独特构想&功能の蛋白质
抗菌肽
肽类抗生素
机体天然产生 / 天然免疫の重要组成部分
对 耐药菌 有强大 抗菌作用
一类 阳离子 小分子 多肽，具有 广谱抗菌活性
全新蛋白设计
根据 所希望得到の 蛋白质结构&功能 → 设计 氨基酸序列，
称：反折叠研究
需要了解：蛋白质结构&功能之间の关系
提出基本结构图样
确定氨基酸顺序
结构优化
取得的进展
创造全新蛋白质
基因水平の蛋白质工程 の三个层次
初级改造
个别氨基酸的改变
一整段氨基酸序列的删除、置换or插入
高级改造
蛋白质分子の剪裁
如：结构域の拼接，融合蛋白技术
从头设计合成 新型蛋白质
列举3例 蛋白质工程在食品中の应用
引入二硫键 → 改善蛋白质的热稳定性
转化氨基酸残基 → 改善蛋白质热稳定性
改变酶的最适pH值条件 → 提高玉米中赖氨酸の含量
