导图社区 酶工程
这是一篇关于酶工程的思维导图，包含酶分子修饰、酶固定化、在食品工业中的应用等。
这是一篇关于蛋白质工程的思维导图，干货满满，感兴趣的小伙伴可以参考使用！
这是一篇关于细胞工程的思维导图，包含研究范畴、应用、细胞培养、细胞融合技术等。
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第14章DNA的生物合成读书笔记
酶工程
酶の化学本质
一类 由 活细胞产生の、具有催化活性作用&高度专一性 の 特殊蛋白质，
又称：生物催化剂
概念
又称：酶技术
利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品的过程，是酶学理论与化学工程相结合而形成的一门科学技术。
分类
化学酶工程 （初级酶工程）
自然酶
化学修饰酶
固定化酶
人工合成酶
生物酶工程 （高级酶工程）
酶学&以基因重组技术为主的现代分子生物学技术 结合的产物
克隆酶
突变酶
新酶酶
在非水相介质中的催化作用
酶反应器&酶传感器
发展简史
酶の制备&发酵生产
主要途径
从生物细胞内直接提取
化学合成
微生物发酵生产获得 酶
常用の产酶微生物
细菌
放线菌
霉菌
酵母菌
……
用于食品酶制剂の细胞 应具备の条件
安全可靠、非致病菌
稳定性好，不易退化，不易感染噬菌体
酶产量高，有较好的开发应用价值
容易培养和管理，产酶细胞易生长繁殖
能利用廉价的原料，发酵周期短
发酵方法
固体 发酵法
液体 发酵法（主要）
间歇(分批)发酵法
连续发酵法
工艺条件&控制
条件
培养基
温度
pH
溶氧量
发酵时间
原则
（先）利于 菌体生长→最适条件
（再）不影响 酶の形成→酶生产の需要
提高酶产量の方法
基因重组技术 选育 优良细胞
强化 生产过程
控制 合理 发酵条件
pH、温度、基质浓度……
添加 底物/底物相似物/前体物质
如：异丙基-β-D巯基半乳糖 → β-半乳糖苷酶产量增加1000倍。
控制 阻遏物 浓度
产物积累一定浓度，合成受阻。
添加 表面活性剂
主要是 非离子型表面活性剂。
添加产酶促进剂
植酸钙镁、聚乙烯等。
酶の分离纯化
细胞破碎
机械 破碎
原理
机械运动：剪切力→组织、细胞破碎。
方法
捣碎法
研磨法
匀浆法
物理 破碎
各种物理因素→组织、细胞の外层结构破坏→细胞破碎。
温度差
压力差
超声波
化学 破碎
各种化学试剂→细胞膜→细胞破碎。
有机溶剂
苯甲、丙酮、丁醇、氯仿
表面活性剂
Triton、Tween
酶解 破碎
细胞本身酶系 or 外加酶制剂 の催化作用→细胞外层结构 破坏→细胞破碎。
自溶法
外加酶制剂法
提取
纯化
透析
蔗糖梯度溶液
离心
基本原理：不同浓度の蔗糖溶液，蛋白质分子 相对分子量不同→沉降速度不同→高速离心→酶&蛋白质：沿浓度梯度→各自の区（每个区带只含一种酶/蛋白质）
酶の分子修饰
改变 酶分子の结构→酶的某些性质&功能发生改变
主要方法
化学修饰
化学手段→将某些化学物质/基团结合到酶分子上，或将酶分子的某些部分删除/置换，→改变酶的理化性质→改变酶催化性质的目的。
大分子结合修饰
大分子：氢键（非共价作用）/共价连接→酶分子表面→保护层→稳定性↑
侧链基团修饰 （小分子修饰）
小分子 共价修饰酶→酶表面の一些基团
分子内or分子间交联
双/多功能试剂→酶更稳定
戊二醛
二亚胺
肽键有限水解修饰 （酶蛋白主链修饰）
肽链の限定肽键位点：水解→酶空间结构：改变→改变 酶特性&功能
氨基酸置换修饰 （活性基团修饰）
选择性修饰 氨基酸侧链成分→改变 氨基酸の取代→改变 活力中心の氨基酸→改变 酶的特性
金属离子置换修饰
酶分子中の金属 取代→改变 酶的专一性、稳定性 及其抑制作用
物理修饰
物理方法→不改变酶の组成单位&基团，只使酶分子的空间构象发生改变(副键变化或重排)→改变酶的某些特性和功能。
高压处理
酶活提高
最适条件改变
适当变性 改变 空间构象
稳定性适当提高
酶の固定化
酶的固定化の概念
酶&不溶性载体→结合→使 游离酶、细胞或细胞器等的催化活动 完全或基本上限制在一定空间内的过程。
固定化后的酶：仍具有酶的催化活性，能连续进行反应，并且反应后的酶可以回收重复使用。
吸附法
吸附方法
物理吸附
氢键、疏水作用、π电子亲和力 → 酶 固定于 水不溶载体
载体
有机载体
淀粉、谷蛋白、纤维、甲壳素……
无机载体
活性炭、多孔玻璃/陶瓷、氧化铝、硅胶……
代表性酶
α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶
特点
吸附容量较低
（一般<1mg蛋白/g吸附）
酶活力损失少
与载体结合力较弱，易脱落
离子吸附
适宜pH&离子强度 → 酶の侧链解离基团 & 含有离子交换基团の水不溶性载体 → 静电作用力→结合
阴离子交换剂
阳离子交换剂
β-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶、DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶
优点
操作简单，处理条件温和，可以得到 较多 高活性的固定化酶；
可充分选择 不同电荷、不同形状 的载体，
吸附过程 可以 同时纯化酶，
固定化酶在使用过程失活后可 重新活化，同时载体可以 回收再利用。
缺点
吸附法制备的固定化酶 易脱落，影响产物纯度&操作的稳定性。
包埋法
一定方法 → 酶 包埋于 半透性の载体
包埋方法
凝胶 包埋法
酶或含酶菌体 包埋在各种 凝胶内部的微孔中 ，制成的固定化酶/固定化菌体。
常用凝胶
琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。
条件温和，对酶活影响小，但强度差。
半透膜 包埋法
又称：微胶囊包埋法，指将 酶分子 定位于 半透性の聚合体膜内 ，制成微胶囊型酶。
常用半透膜
聚酰胺膜、火棉胶膜、硝化纤维、聚苯乙烯、壳聚糖等。
微胶囊大小可控制、胶囊化时间短、酶与底物接触表面积大、多种酶可固定于同一胶囊，利于多酶固定。
操作简单，
只被包埋，未化学反应→较高活力的固定化酶，
对大多数 酶、粗酶制剂，甚至 完整の微生物细胞 都是适用的。
只有小分子底物&产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。
凝胶网络对物质扩散的阻力 导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。
共价键结合法/共价偶联法
酶蛋白の侧链基团 & 载体表面の功能基团→共价键结合
与 载体共价结合の酶功能基团
氨基、酚基、咪唑基、巯基、羟基、吲哚基等
天然有机载体（纤维素、琼脂糖）
合成高聚物（尼龙、多聚氨基酸）
无机载体（多孔玻璃、金属氧化物）
结合方法
重氮化法、烷基化法、芳基化法、缩合反应、叠氮反应、巯基-二琉基交换法、金属偶联反应等。
结合牢固，不易脱落，利于连续使用。
载体活化操作复杂，
且制备过程中酶直接参与化学反应，易引起酶结构变化，使固定化酶活力降低或破坏，回收率低(约30%)。
交联法
双/多功能试剂 → 在酶分子之间 or 酶与载体间 or 酶与惰性蛋白间→交联反应
常用交联剂
戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺酸……
交联反应
酶浓度高→发生在：酶分子之间
后：不溶态
酶浓度低→发生在：酶分子内部
交联方法
直接交联法
戊二醛溶液 → 酶溶液 → 不溶性固定化酶
酶辅助蛋白交联法
双/多功能试剂 → 惰性蛋白&酶→交联
载体交联法
双/多功能试剂の一部分功能基团&载体→交联， 另一部分功能基团&酶蛋白→交联
吸附交联法
酶 吸附于 吸附剂（硅胶、皂土、氧化铝 等）→ 与 双功能试剂 交联
结合牢固，可长时间使用；
但条件剧烈，酶活损失大，
固定化酶颗粒小，使用不方便。
改进
于 吸附法/包埋法 结合使用
优缺点
易于将酶与底物及产物分离，因而产物相对容易提纯；
能够重复利用，使用效率提高，成本低；
大多数情况下可以提高酶的稳定性；
可以增加产物的收率，提高产物质量；
有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用
特别固定化过程中酶的活力难免有一定损失；
只适用于水溶性的、小分子底物；
与完整菌体相比，不适用于多酶反应，是需要辅助因子的反应。
性质
活力：通常会降低↓
原因
构象改变
酶与载体的相互作用引起酶活力中心的构象发生变化(主要发生于吸附法和共价偶联法)，导致酶活性下降。
立体屏蔽效应
由于载体对酶的活性中心或调节中心的空间位阻，影响酶与底物的接触。
稳定性：通常会提高↑
热稳定性↑
pH-酶活力 关系
反应的最适pH&酶活力-pH曲线 ：变动 ←依据： 酶蛋白&载体の电荷
带负电荷
最适pH：向 碱性 方向移动
带正电荷
最适pH：向 酸性 方向移动
对蛋白酶的抵抗力提高↑
蛋白酶分子量大，无法进入固定化酶中
对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高↑
操作稳定性↑
可长期使用
半衰期较长
贮藏稳定性↑
固定化 增加酶构象の牢固程度
抵挡 不利因素对酶の侵袭
限制 酶分子间の相互作用
在食品工业中的应用
改进啤酒生产工艺，提高啤酒质量
固定化生物催化剂酿造啤酒新工艺
固定化酶用于啤酒澄清
添加蛋白酶&葡萄糖氧化酶，提高啤酒稳定性
+蛋白酶：提高啤酒稳定性
+葡萄糖氧化酶：提高啤酒稳定性&保质期
葡聚糖酶 提高啤酒的持泡性
大麦→β-葡聚糖：过多→难过滤、浑浊；沉淀
降低啤酒中 双乙酰含量
改进工艺，生产 干啤酒
改进果酒果汁饮料的生产工艺
果汁 提取、澄清、过滤
食品保鲜
酶法保鲜
葡萄糖氧化酶
除氧保鲜
蛋类制品の脱糖保鲜
溶菌酶
利用固定化酶生产 高果糖浆
酶法生产 新型低聚糖
低聚果糖
异麦芽寡糖
α-葡萄糖苷酶→
低聚半乳糖
酶法生产 环状糊精
环状糊精の作用
使易挥发、氧化和光分解的物质稳定化
改变物质的理化基础
改变被包接络合物分子的反应性能
酶法应用于干酪制品的生产
凝乳酶
