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DNA重组和重组DNA技术
这是一篇关于4-23.DNA重组和重组DNA技术的思维导图，重组DNA技术(recombinant DNAtechnology)是指在 体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。
编辑于2024-01-05 17:25:26
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DNA重组和重组DNA技术
DNA重组（DNA recombination）是指不同DNA分子断裂和连接引起DNA片段的交换并重新组合，形成新DNA分子的过程。
重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。
第一节、自然界DNA重组和基因转移 DNA Recombination and Gene Transfer in Nature
真核原核
同源重组 (homologous recombination)
位点特异的重组(site-specific recombination)
转座重组(transposition recombination)
原核
接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation)
转导作用 (transduction)
真核原核
CRISPR/Cas系统
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。
一、Holliday模型是最经典的同源重组模式
1964年，Holliday R提出，4个关键步骤
①两个同源染色体DNA排列整齐
②两个DNA中两条方向相同的链在相同位置上同时切开；双螺旋稍微裂开，释放出单链

③在切口处发生链的交换

④连接分子通过分支移动产生异源双链DNA

⑤Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA
Holliday中间体切开方式不同，所得到的重组产物也不同
片段重组体

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA
拼接重组体
切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA

Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。 但是，DNA单链断裂是很常见的现象。
Meselson-Radding模型
Matthew Meselson 和 Charles Radding对Holliday 模型进行了修改。
① 在一个双螺旋上产生单链切口
② 利用切口处3'-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5'-P为末端的单链区
③ 游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D-环（D-loop）
④ D-环单链区被切除，两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉

⑤ 与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。
⑥ 如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样。

双链断裂模型
更多事实表明，DNA重组是由DNA双链断裂启动的。
两个同源DNA分子之一发生双链断裂，另一个完整。
① 核酸外切酶的作用下，切口扩大，形成2个3’单链末端
② 一个3’单链末端侵入供体双链同源区，并取代其中的一条链，形成D环。

③ 侵入链被DNA聚合酶延伸，D环不断扩大。
④ 当D环的长度超过断裂DNA分子上被降解的区域，断裂DNA分子的另一3’单链末端就与D环的单链区退火，并作为引物被DNA聚合酶延伸。
⑤ 断裂受体DNA分子上被降解的区域得到了修复，同时形成两个分支点，分支点会沿着DNA移动，发生分支迁移。

二、RecBCD模式是大肠埃希菌的Holliday同源重组 ——细菌DNA重组-双链断裂模型 RecBCD同源重组
1. 参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋白。
RecBCD复合物
具有三种酶活性
核酸酶活性
依赖ATP的核酸外切酶活性
可被ATP增强的核酸内切酶活性
需要ATP的解旋酶活性
ATPase
RecBCD复合物利用ATP水解提供能量，沿着DNA链运动，并以较快的速度将前方DNA解旋
在Chi位点形成3'游离单链。
Chi位点（重组热点）5′-GCTGGTGG-3′
Chi位点能够改变RecBCD的酶活性。
一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。
RecA蛋白
RecA蛋白可结合单链DNA（ssDNA），形成RecA-ssDNA复合物。
在有同源DNA存在时，此复合物可与含同源序列的靶双链DNA相互作用，并将结合的单链DNA插入双链DNA的同源区，与互补链配对，而将同源链置换出来
RuvC专一性识别Holliday交叉的核酸内切酶。
2. E.coli的RecBCD同源重组过程
① RecBCD复合物识别双链断裂的断裂口平端或近似平端，然后向上游边移行边解链
② 优先降解3'末端链；当遇到Chi位点时，只降解5'末端链
③ RecA蛋白催化3'-单链DNA对另一双链DNA的侵入，并与其中的一条链交叉，继而交叉分支移动，待相交的另一条链在RecBCD内切酶活性催化下断裂后，由DNA连接酶交换连接缺失的远末端，形成Hollliday中间体
④ 此中间体再经RuvC切割和DNA连接酶的连接，最后完成重组

二、位点特异重组是发生在特异位点间的DNA整合
位点特异重组(site-specific recombination)发生在至少拥有一定程度序列同源性片段间DNA链的互换过程。也称保守的位点特异性重组。
位点特异性重组酶（site-specific recombinase, SSR）识别和结合特异性DNA短序列（特异位点），使DNA片段发生的整合
位点特异重组结果取决于重组位点的位置和方向。
（一）λ噬菌体DNA可与宿主DNA发生整合
λ噬菌体的整合酶（Int）识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；
反转录病毒的整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。
① λ噬菌体DNA的重组位点attP与大肠埃希菌基因组DNA的重组位点attB之间有15bp的核心序列相同
② 在整合酶Int和整合宿主因子IHF作用下可发生整合，由Xis参与切除过程

（二）基因片段倒位是细菌特异位点重组的一种方式
鼠伤寒沙门氏菌由鞭毛蛋白决定的H抗原有两种，分别为H1鞭毛蛋白和H2鞭毛蛋白。
沙门氏菌的Hin重组酶可以使染色体上的H片段倒位，表达出另一套可选的基因，从而有助于细菌进入宿主的免疫系统。
① H片段的两端为14bp的特异性重组位点（hix），其方向相反，发生重组后可使H片段倒位。
② H片段上有两个启动子（P），其一驱动hin基因表达，另一个驱动H2和 rH1基因表达，倒位后H2和rH1基因不表达。
③ hin基因编码特异的重组酶，即倒转酶Hin，该酶为同源二聚体，分别结合在两个hix位点上，并由辅因子Fis促使DNA弯曲而将两个hix位点连接在一起，DNA片段经断裂和再连接而发生倒位。
④ rH1表达产物为H1阻遏蛋白，当H2基因表达时，rH1也表达，从而使H1基因被阻遏；反之，反向（倒位）时H2基因不表达时，rH1也不表达，H1基因阻遏被解除。

（三）免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链和两条重链组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链，一个编码重链。
轻链的基因片段
重链的基因片段

重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。
三、转座重组可使基因移位
转座重组(transpositional recombination) 或转座(transposition)是指由插入序列和转座子介导的基因移位或重排。
在染色体组内移动，从一个位点切除，插入到一个新的位点，引起基因的突变或染色体重组。
由McClintock（1950-51），在玉米上首先发现跳跃基因，遗传学发展史上的重要里程碑之一。
玉米染色体互换和连锁基因的重组关系-玉米连锁遗传图谱
（一）插入序列是最简单的转座元件
插入序列（IS）是指能在基因（组）内部或基因（组）间改变自身位置的一段DNA序列。
1. 保守性转座
IS从原位迁移至新位
2. 复制性转座
IS复制后的一个复制本迁移至新位

（二）转座子可以在染色体间转座
转座子(transposons，Tn) —能够将自身或其拷贝插入基因组新位置的DNA序列。
真核原核普遍存在。染色体内，染色体间，细胞间跳跃
转座子组成：
反向重复序列
转座酶编码基因
抗生素抗性等有用的基因

在很多Tn中，其侧翼序列本身就是IS
插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)
转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因
转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L

Tn移动：插入突变，新基因生成，染色体畸变，生物进化
四、原核细胞通过接合、转化和转导进行基因转移或重组
（一）接合作用
定义
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。
只有某些较大的质粒，如 F 因子(F factor)，可接合作用
F 因子决定细菌表面鞭毛形成。

（二）转化作用
定义
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。

受体菌必须处于敏化状态，这种敏化状态可通过自然饥饿、生长密度或实验室诱导而达到。
较大的外源DNA不易透过细胞膜，自然界发生转化作用的效率不高，染色体整合概率更低
（三）转导作用
定义
是病毒将供体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象 。
噬菌体介导的转导
普遍性转导：供体菌DNA片段被包装入噬菌体---再感染，入受体菌
特异性转导：噬菌体位点特异性重组整合入宿主菌，切割时，携带位于整合位点侧翼的DNA片段----再感染，入受体菌
DNA重组是细胞内经常发生的过程，它在物种变异，生物进化，调控基因功能方面具有重要作用。
人们受到启发在20世纪70年代发展建立了体外基因重组技术，可以人为的改变生物的遗传信息.
五、CRISPR/Cas9基因编辑技术

1.CRISPR/Cas系统概述 （细菌获得病毒DNA用于攻击病毒）
1987年，日本石野良纯课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中
2002年，西班牙微生物学家弗朗西斯科·莫伊卡，科学家将其正式命名为clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)；细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关
2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。
2007年，Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抵抗噬菌体入侵。 2008年， Marraffini ，抵御外源质粒入侵。
2011年，分离Cas9蛋白，发现它是双RNA引导的DNA内切酶；确定CRSPR如何和Cas蛋白一起发挥作用。
2012年发现并证实来自化脓链球菌的spCas9蛋白的CRISPR系统，最适合做基因编辑工具，并用它成功编辑了大肠杆菌基因
2013年，张峰，用CRISPR/Cas9系统编辑哺乳动物基因
2013年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
2.CRISPR/Cas系统结构
① CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
Cas
CRISPR-associated gene；双链DNA核酸酶；能在guide RNA 引导下对靶位点进行切割
CRISRP：成簇间隔短回文序列
重复序列
宿主菌基因组的“隔板”21-48bp
间隔序列
来自不同噬菌体DNA；通过间隔序列与靶基因识别；26-72bp
② 产脓链球菌的典型TypeⅡCRISPR/Cas基因座
5'端为tracrRNA基因
中间为一系列Cas蛋白编码基 因，包括Cas9, Cas1, Cas2和Csn2
3'端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺序排列组成

3.外源DNA可插入宿主基因组的CRISPR座位中
当噬菌体感染宿主菌时
靶向性复合物与病毒DNA片段形成Cas1Cas2复合物
Cas1Cas2复合物将病毒DNA片段插入宿主菌基因组DNA的CRISPR座位的第一个位点
插入的DNA片段两端是重复序列
4. CRISPR/Cas系统是细菌的获得性免疫机制
根据Cas蛋白的功能可将其分为三型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统是目前应用最多的
CRISPR/Cas9系统是一种细菌防御病毒和质粒攻击的获得性免疫机制，目前已经被开发成种应用最多的高效率、低脱靶率的基因组编辑( genome editing)技术。
① CRISPR座位转录产生pre-crRNA
② tracrRNA基因转录产生tracrRNA
③ tracrRNA与pre-crRNA在cas9作用下形成引导RNA（gRNA）-cas9复合物
④ gRNA-Cas9复合物靶向入侵病毒DNA并将其切割消化

① Ⅱ型系统中由重复序列及间隔序列(spacer)组成的CRISPR座位经转录产生CRISPR-RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)和tracrRNA (trans-encoded crRNA) ； ② tracrRNA与pre-crRNA的重复序列区互补配对产生局部双链RNA(dsRNA); ③ RNase Ⅲ识别并切割dsRNA产生向导crRN (guide crRNA, gerRNA) ; ④ 宿主细胞表达的Cas9核酸酶与gcrRNA结合形成Ca9-crRNA复合物; ⑤ 当含有相同间隔序列的噬菌体或质粒再次入侵时, Cas9-crRNA复合物与入侵DNA上的原间隔序列(protospacer)互补配对形成由protospacer/crRNA组成的R-环双链结构, Cas9识别并切割R-环，从而在入侵者的基因组上产生切口。 ⑥ Cas9切割的靶序列下游有一个紧邻原间隔序列基序( protospacer-adjacen moti, PAM)，可能对于Cas9寻找靶序列有一定作用。
书
通过设计导向RNA，使之与细胞基因组的特定位点相结合，研究者们可以将Cas酶定位到他们感兴趣的基因位点进行切开，常用的Cas酶类型是Cas9。DNA切开将引发DNA的修复，从而使我们能够对这一兴趣位点进行精确的编辑。
第二节 重组DNA技术 Recombinant DNA Technology
重组DNA技术，又称分子克隆（molecular cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因工程（genetic engineering）技术
其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，重组DNA分子进而在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。
重组DNA技术的发展史
1972年 P. Berg构建第一个重组DNA分子(猿猴病毒DNA和λ噬菌体DNA)

1977年 美国旧金山博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。
1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂
目的：
① 分离获得某一感兴趣的基因 DNA
② 获得感兴趣基因的表达产物 蛋白质
一、重组DNA技术中常用的工具酶
1. 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)
定义
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯键。
分类
属DNA内切酶类，来源于细菌，分三型
Ⅰ 型 ：识别特异性的DNA序列，没有固定的切割位点，在离识别位点很远的地方任意切割DNA链。
Ⅲ 型 ：切点在识别位点以外。
Ⅱ 型 ：识别特异DNA顺序，并在此切割
分子剪刀
作用
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。犹似高等动物的免疫系统。
在DNA重组中用II型限制性内切酶
命名
四个字母+罗马数字
第一个字母：大写 表示该菌的属名
第二、三个字母：小写 表示该菌的种名
第四个字母：（有时无） 表示该菌的株名
罗马数字：酶的编号（按发现的顺序）
如 Eco RI , Bam HI , Hin dⅢ, Not I

E=Escherichia，埃希氏菌属
co=coli，大肠杆菌菌种
R=RY13，菌株名
I=第一个被分离到的内切酶
限制酶的识别位点：
通常4-6个碱基具有回文结构序列的DNA片段
有些限制酶识别序列为8个或8个以上碱基对
切割位点：大多数酶是错位切割，产生粘性末端，少数酶产生平端或称钝端
Ⅱ型酶
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)

切口
平端切口
HindⅡ
黏端切口
BamHⅠ
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。
BamHⅠ和BglⅡ
同裂酶
来源不同的限制酶，但能识别同一序列（切割位点可相同或不同），这些酶称同裂酶或同功异源酶。
BamHⅠ和BstⅠ
2. DNA聚合酶Ⅰ
Klenow fragment：
枯草蛋白酶水解DNA聚合酶I产生的大片段 分子量76kD
酶活性
5’—3’聚合酶活性
3’—5’外切酶活性
主要作用：
补齐双链DNA的3’末端
缺口平移制备探针
在cDNA克隆中，合成双链cDNA分子或片段连接
DNA序列分析
3. 逆转录酶
常用的有两种：AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶
模板：RNA
底物：dNTP
合成方向：5’—3’
主要作用：合成cDNA，建立cDNA文库
4. T4DNA连接酶 (T4 DNA ligase)
主要作用
催化两个相邻的3′-OH和5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键
5. 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase)
主要作用
除去5’端磷酸根
防止载体自身连接
提高重组效率
6 末端脱氧核苷酰转移酶 TdT 俗称加尾酶
主要作用
将脱氧核苷酸加到DNA的3’-OH
用于探针标记
或形成同聚物尾的粘性末端便于连接
7. Taq DNA聚合酶
特点：可耐高温
主要用途：PCR DNA测序
具有5′→3′聚合酶活性及5′→3′外切酶活性，但没有3′→5′外切酶活性，该酶没有校正功能，故在PCR反应中如果发生碱基错配。
目前研发出多种高保真耐高温DNA聚合酶，如Pfu，大大降低了PCR过程中的碱基错配率。
二、重组DNA技术中常用的载体
定义
为使携带的目的基因实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子
载体应具备的基本条件
1. 针对受体细胞有亲缘性或亲和性（可转移性）
2. 与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
3. 具有较高的外源DNA的载装能力
4. 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点
5. 具有合适的筛选标记
6. 提供在受体细胞中的表达能力（表达载体）
载体的分类
克隆载体(cloning vector)：
克隆载体是指可以携带外源基因或DNA片段进入受体细胞并使外源DNA大量扩增的复制单元，适用于复制扩增外源DNA。
1. 克隆载体应具备的基本特点
1. 有复制起点，可自主复制，使外源DNA得到同步扩增；
2. 有选择性遗传标记，包括抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因、营养缺陷耐受基因等。
3. 有一段特异核苷酸序列，包含了多个RE的单一切点，叫多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）。(MCS是人工合成的一段含有多个不同的单一限制性内切酶切点的DNA序列，它有利于外源基因插入该区域。)
4. 拷贝数高(10—200个／每个细胞)，易于分离。
5. 生物安全性
2. 常用的克隆载体
① 质粒（容纳片段：≤10kb) plasmid
1. 质粒载体应具备的必要条件
① 有多种限制性内切酶切点，多克隆位点MCS，但每种切口最好只有1个；
② 有筛选选择标记，如抗药性标记， β-半乳糖苷酶基因(lac Z)蓝白斑试验；
③自我复制，拷贝数多。（松弛型）
④有一定容量。质粒一般只能容纳10kb的DNA片段。
2. 常用的质粒载体
① pBR322质粒
人工组建的克隆载体
大小：4.36kb
选择标记：Amp^r，Tc^r（四环素抗性）
单一酶切位点：EcoRⅠ，HindⅢ，BamHⅠ，PstⅠ，SalⅠ等
高拷贝数

② pUC质粒序列 pUC18/19
pUC质粒系列是在pBR322基础上改建的。
含有pBR322的大部分，包括完整的amp^r基因和复制起始点。去除了pBR322的tet^r区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头。

pUC质粒系列三个显著特点
① 分子量更小，仅2.7KB，容纳外源DNA量增大；有高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。
② 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα ，可利用α-互补原理进行蓝白筛选。
β-半乳糖苷酶筛选系统（蓝白筛选）
原理
载体上带有来自大肠杆菌lac操纵子的DNA区段，该区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的蛋白片段（ α- 片段）。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可以诱导该片段的合成。
该片段能与宿主细胞编码的β-半乳糖苷酶羧基端的蛋白片段互补(α-互补)。
暴露于IPTG的细菌若含有编码lacZ的质粒就可同时合成该酶的两种片段，在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色菌落。
将MCS克隆入β-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入MCS后使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，破坏了α-互补作用。
因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。
空载体：blue
重组质粒：white
③ 有人工合成的多个单一酶切位点（MCS），其MCS区与M13mp噬菌体载体相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。
③ 穿梭质粒
质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。
哺乳动物细胞表达载体是从克隆载体上发展起来的，如穿梭质粒，要在细菌中增殖，含有必不可少的原核序列：包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。
② 噬菌体 phage
本质为细菌的病毒
容量大，常用作基因组文库和cDNA文库载体
双链噬菌体： λ噬菌体
单链噬菌体：M13、f1
尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞
自主复制繁殖性使外源基因在受体细胞中高效扩增
λ噬菌体 (容纳片段：9-23kb)
线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos。
野生型基因组含有60多个基因，约48.5kb
溶菌性：感染细菌后连续增殖，破坏菌体，释放出噬菌体，清亮噬菌斑
溶原型：整合生长，和细菌的染色体一起复制，浑浊噬菌斑
λ噬菌体作为克隆载体的两型
替换型载体 （适用基因组克隆）：含有某一个限制酶的2个切点，切点间的DNA 可被目的基因(9~23kb)所替代。长度为野生型的75%-105%才可包装，未插入DNA片段，载体DNA太小，不能包装 （重组标记）。用于DNA文库和cDNA文库的构建
插入型载体（适用cDNA克隆）：含有某一个限制酶的1个切点，目的基因(~10kb)插入使特定基因失活 。如 λgt10/11
M13噬菌体
单链环状DNA，基因组全长约6.5kb
感染菌体后，经复制转变为双链（RF DNA），分离后可作克隆载体
RF DNA在菌体中复制100-200拷贝后，产生单链DNA，并包装到成熟的噬菌体颗粒中排出
M13克隆能力有限，仅1.5kb.
可用于测序，探针
③ 柯斯质粒（cosmid）载体（又称粘粒载体）(容纳片段40-50kb)
λ噬菌体的cos区粘性末端与质粒构建的载体, 双链环状DNA，分子量4-6kb。有λ噬菌体和质粒两方面优点.
含有抗药性标记和复制起始部位
有一个或多个单一酶的切割位点
有λ噬菌体的粘性末端（cos区，包装必须）。可像噬菌体一样包装成具有感染性能的噬菌体颗粒
克隆容量：40-50kb，非重组体不能体外包装，只有重组体才能包装并感染细菌
可用于真核细胞构建基因组文库.
④ 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)
人工染色体(artificial chromosome)指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、哺乳动物人工染色体（MAC）。人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具
⑤ 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)
把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。
YAC载体装载量350～400kb
YAC载体应含有下列元件
酵母染色体的端粒序列
酵母染色体的复制子
酵母染色体的中心粒序列
酵母系统的选择标记
大肠杆菌的复制子
大肠杆菌的选择标记
TEL：telomeric repeat 端粒重复序列
CEN：centromere 着丝粒
ARS：autonomously replication sequences自主复制序列
Selectable markers on each arm： (TRP1 and URA3)

BamHⅠ切割形成微型酵母染色体→EcoRⅠ切割形成染色体两臂→外源DNA 插入→转化入酵母菌→复制、克隆大片段DNA
⑥ 动物病毒DNA改造的载体
（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）

表达载体(expression vector):
表达载体是用于表达原核或真核细胞中某个特定基因所编码的蛋白质产物的载体，其克隆位点的上游含有强启动子、下游含有转录终止序列，适用于表达某特定蛋白质。
指在宿主细胞中表达（转录和翻释）外源基因的载体。
除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件—转录和翻译所需的DNA序列。
基本要求：一个强的启动子、两侧的调控序列和转录终止信号。
根据宿主细胞分为
原核表达载体
真核表达载体
蛋白表达方式
非融合表达
表达产物直接是单一目的蛋白质
融合表达
表达产物不仅含有目的蛋白，还带有一段融合的其他的标签序列用于检测和纯化，最后应用时，可能需要切除标签序列
1. 原核表达载体
原核表达载体的基本组成
克隆元件
复制位点、抗性基因、克隆位点、可以导入大肠杆菌，这些特点与克隆载体一样
表达系统元件
启动子、核糖体结合位点、转录终止序列

常用的大肠杆菌表达载体
非融合蛋白表达载体
pKK223-3 tac启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子） IPTG诱导表达

强启动子Ptac
紧接启动子MCS
强终止子rrnB
IPTG诱导
pBV220 PL(PR)启动子（λ噬菌体的左向和右向启动子） 温度诱导表达
融合蛋白表达载体（IPTG诱导）
pGEX系列载体 谷胱甘肽巯基转移酶＋目的基因

tac启动子
GST基因
多克隆位点
IPTG可诱导
可用标签纯化
pMAL系列载体 麦芽糖结合蛋白＋目的基因
pRSET系列载体 ６个组氨酸＋目的基因
分泌性表达载体
pIN Ⅲ系列载体 信号肽
pIN Ⅲ系列载体是较常用的分泌型表达载体。
以pBR322为基础构建而成，带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即lpp（脂蛋白基因）启动子，
含编码信号肽的序列，取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa （外膜蛋白基因）。
细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌

原核细胞表达系统优缺点
优点
系统简单，易操作
成本低，易于大量生产
生长周期短
缺点
翻译后需要修饰的蛋白不能用此类表达系统
2. 真核表达载体
真核表达载体组成
① 要在细菌中增殖，含有必不可少的原核序列
包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等
② 真核表达载体中还具有
1. 真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止子、polyA加尾信号等
2. 真核细胞复制起始序列
3. 真核细胞药物抗性基因
不是所有真核表达载体都有整合序列
例子
含有来自CMV的启动子和增强子
源于牛生长激素基因的PolyA加尾信号序列.
真核原核复制起始点
含有显性药物抗性基因 neo^r，其产物可使G418 抗生素磷酸化而灭活，使细胞具有neor。
此外还含有转录终止信号、多聚腺苷酸化信号。

真核表达载体的启动子
某些来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞范围较广，如Rous肉瘤病毒（RSV ）、猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）、人类巨细胞病毒（CMV）启动子等。这些启动子和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表达载体中被普遍使用。
真核细胞表达系统的优缺点
优点
可用于翻译后需要修饰的蛋白表达
缺点
成本高
表达系统相对复杂
生长周期长
三、重组DNA技术基本原理和操作步骤
基本原理
制备目的基因
载体的选择
目的基因和载体的连接
将重组体导入受体细胞
DNA重组体的筛选和鉴定
操作步骤
（一）分：分离获取目的基因
1. 化学合成法，人工合成基因 已知目的基因的序列或产物的氨基酸序列。
目的基因可用DNA合成仪合成较小的DNA片段，然后再用其他反应将它们连接起来
优点
可修饰基因
可在基因两端设计接头
可选择各种宿主生物偏爱的密码子
2. 从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA

3. PCR法
PCR是一种高效特异的体外DNA扩增的方法
可用含有目的序列的DNA为模板或mRNA为模板RT-PCR扩增目的DNA
4. 其他方法
（二）选：载体的选择与构建
进行DNA克隆的目的：
① 获得目的DNA片段---克隆载体
② 获得目的DNA片段所编码的蛋白质---表达载体
目的DNA的大小、受体细胞的种类和来源等因素
载体内应有适宜的多克隆位点
目的基因和载体的限制性酶切
限制酶的选择：酶切位点位于基因两侧，在基因内部无切点
双酶切：产生两种不同末端，而定向插入。
目的基因和线状载体DNA片段的分离和回收
（三）接：目的DNA与载体连接
1. 黏端连接
方式
（1）单一相同黏端连接
载体自连
重组体
目的基因自连
（2）不同黏端连接（定向克隆）
重组体
（3）通过其他措施产生黏端进行连接
人工接头（linker）连接
由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行黏端连接
同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。
PCR
针对目的DNA的5'-和3'-端，设计一对特异引物，在每条引物的5'-端分别加上不同的RE位点，然后以目的DNA为模板，经PCR 扩增便可得到带有引物序列的目的DNA，再用相应RE切割PCR产物，产生粘端，随后便可与带有相同粘端的线性化载体进行有效连接。
T-A克隆法
在使用Taq DNA聚合酶进行PCR时，扩增产物的3′ 末端可加上一个单独的腺苷酸残基（A）而成为黏端，这样的PCR产物可直接与带有3′-T的线性化载体（T载体）连接，此即T-A克隆。
2. 平端连接
适用于
限制性内切酶切割产生的平端
黏端补齐或切平形成的平端
方向问题
重组体
载体自连
目的基因自连
3. 黏-平末端连接
黏-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接
属于定向克隆
重组酶介导的连接
目的DNA与载体在试管中以同源重组的方式形成重组DNA
购买具有特殊序列末端的线性载体，PCR扩增目的DNA，引物5'端添加15bp载体末端序列
（四）转：重组DNA转入受体细胞
受体菌条件：
安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent)
导入方式：
转化 (transformation)
将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型。常见的是大肠杆菌．
① CaCl2处理：用低温CaCl2处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞（即获得摄取DNA的能力），再与重组体混合，42度90秒，接种到平皿中培养。
② 电穿孔转化法：高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，无需置备感受态细胞．
转染 (transfection)
指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA 。
方法
电穿孔法
磷酸钙共沉淀法
脂质体融合法
感染 (infection)
将λ噬菌体、粘粒、真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体，导入宿主细胞的过程。
λDNA的体外包装： λDNA重组体与λ头部及尾部蛋白混合，使之成为完整的噬菌体。粘粒含有的cos区，也可用此方法导入大肠杆菌中。
（五）筛：重组体的筛选与鉴定
1. 借助载体上的遗传标志进行筛选
(1) 利用抗生素抗性标志筛选
(2) 利用基因的插入失活/插入表达特性筛选
(3) 利用标志补救筛选
α互补的检测

(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选
噬菌体
替换型
重组λDNA长度达到野生型的75%～105%时，才能包装成噬菌体颗粒感染宿主菌，呈现清晰的噬斑.
插入型
λgt10 ：外源基因插入CI基因，使其失活，消除溶原作用，形成透明噬菌斑，未重组者形成浑浊噬菌斑。
λgt11；含有lac Z基因， 重组使lac Z基因失活，在含X-gal培养基中形成白斑，未重组者形成蓝斑。
2. 序列特异性筛选
(1) RE酶切法
(2) PCR法
(3) 核酸杂交法

(4) DNA测序法
最准确
3. 亲和筛选法
前提是重组DNA进入宿主细胞后能够表达出其编码产物
原理
抗原-抗体反应
配体-受体反应
第三节 重组DNA技术在医学中的应用 Application of Recombinant DNA Technology in Medicine
一、重组DNA技术广泛应用于生物制药
二、重组DNA技术还应用于医学的其他诸多方面
遗传修饰动物模型的医学研究
传修饰细胞模型的医学研究
基因功能获得与缺失的研究
研究蛋白相互作用