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食品类生物化学中蛋白质的知识点有蛋白质的功能和元素组成、氨基酸、蛋白质分类、肽、结构与功能的关系、蛋白质的重要关系、分子结构、分离纯化技术。
编辑于2021-08-25 16:08:28蛋白质化学
氨基酸
命名、编号
羧基C原子为C-1,与羧基相连的C原子为α-C,也就是C-2
分类
R基非极性(疏水)
含脂肪族烃链
丙氨酸(Ala)
缬氨酸(Val)
亮氨酸(Leu)
异亮氨酸(Ile)
芳香族
苯丙氨酸(Phe)
色氨酸(Trp)
唯一的亚氨基酸
脯氨酸(Pro)
含硫
甲硫氨酸(Met)
R基极性不带电
羟基
丝氨酸(Ser)
苏氨酸(Thr)
苯酚(也含羟基)
酪氨酸(Tyr)
酰胺
天冬酰胺(Asn)
谷氨酰胺(Gln)
巯基(含硫)
半胱氨酸(Cys),2个Cys巯基经氧化后可以形成二硫键
结构最简单
甘氨酸(Gly)
R基带负电
天冬氨酸(Asp)
谷氨酸(Glu)
都是酸性氨基酸,pH>3时分子带负电
R基带正电
组氨酸(His)
侧链带有咪唑基
赖氨酸(Lys)
侧链为丁铵
精氨酸(Arg)
侧链带有胍基
稀有氨基酸
定义:没有对应的遗传密码子,是经过翻译后加工修饰而来
例
4-羟基脯氨酸和5-羟基赖氨酸是胶原蛋白的重要组成成分
N-甲酰甲硫氨酸是所有原核生物蛋白质合成时N端起始氨基酸
γ-羧基谷氨酸存在于与凝血过程有关的蛋白质中
6-N-甲基赖氨酸存在于肌球蛋白,与肌肉收缩、细胞内某些运动过程有关
硒代半胱氨酸,第21种合成蛋白质的氨基酸,是丝氨酸的衍生物,有自己的密码子和特定的tRNA
非蛋白质氨基酸
定义:不参与蛋白质的组成,大多是蛋白质中常见氨基酸的衍生物
例
γ-氨基丁酸是谷氨酸脱去羧基后的产物,是传递神经冲动的化学介质,是抑制性神经递质
鸟氨酸和瓜氨酸,是精氨酸合成和尿素循环中的重要中间代谢产物
酸碱性
偶极离子形式
氨基酸在晶体和水溶液中主要以解离的形式存在,当分子所带的正电荷和负电荷等量时,使整个分子呈现电中性状态,称为偶极离子形式
两性解离
解离常数
K1,α羧基的解离常数
K2,α-氨基的解离常数
滴定曲线
等电点
概念:当溶液处于某一特定pH值时,氨基酸主要以偶极离子形式存在,分子所带净电荷为0,将此时溶液的pH值称为等电点
性质
处于等电点的蛋白质在水溶液中溶解度最低
如果溶液中只有一种氨基酸,当溶液pH高于氨基酸等电点时(pH>pI),氨基酸带负电荷,在电场中向负极移动
计算
立体化学
自然界中,组成蛋白质的氨基酸都是L-型(糖通常都是D型)
自然界中也存在D型氨基酸,但仅存于少数几种小肽
吸收光谱
组成蛋白质的20种氨基酸在可见光区没有吸收
近紫外区
色氨酸,280nm
酪氨酸,275nm
苯丙氨酸,257nm
2个半胱氨酸形成的二硫键,240nm有弱吸收
紫外波段,最大吸收波长280nm
化学反应(名称试剂产物颜色用途)
茚三酮
α-氨基和α-羧基都参与反应
过程
氨基酸与1分子茚三酮在弱酸性溶液中共热,氨基酸氧化脱氨、脱羧→RCHO、CO2、NH3、还原型茚三酮
还原型茚三酮、NH3再与1分子茚三酮反应→蓝紫色复合物,最大吸收峰在570nm
所以1分子aa与2分子茚三酮发生反应
特殊
天冬氨酸与茚三酮反应释放2分子CO2
脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应不释放NH3,生成黄色产物,最大吸收在440nm
Sanger
弱碱性条件,α-氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB/FDNB)发生反应→黄色物质 2,4-二硝基苯基氨基酸(DNP-氨基酸)
多肽/蛋白质氨基酸序列测定:DNFB与肽链N-末端反应生成DNP-肽
Edman
过程
弱碱性条件,苯异硫氰酸酯(PITC)与氨基酸α-氨基反应→PTC-氨基酸
PTC-氨基酸在硝基甲烷中与酸作用,迅速环化生成苯乙内酰硫脲(PTH)衍生物,即PTH-氨基酸 无色产物
可以用作多肽链序列测定
分子结构
一级结构
概念
肽链中氨基酸残基的排列顺序
测定
测定步骤
准备工作
纯化蛋白质
确定其中的肽链数目或亚基数目
断裂肽链中的二硫键
分离纯化不同的肽链或亚基
水解肽链以测定其氨基酸组成
序列测定
用至少两种不同的方法,将长的肽链断裂成一定长度的小肽段并分离
测定每个小肽段序列
多肽链的结构重建
确定完整多肽链序列
确定出二硫键位置、酰胺的位置
具体方法
末端氨基酸残基测定
N末端氨基酸残基
Edman降解法
Sanger法
丹磺酰氯法
氨肽酶法
C末端氨基酸残基
肼解法
还原法
羧肽酶法(需要严格控制反应时间)
断裂二硫键的方法
过甲酸氧化法
巯基试剂还原法
二硫键位置的确定
胃蛋白酶水解结合对角线电泳
多肽链的断裂方式
蛋白酶断裂法
胰蛋白酶
专一性强,专一打断Arg或Lys的羧基形成的肽键
通常可以得到大小合适的片段,可以直接用于序列分析
胰凝乳蛋白酶
专一性不如胰蛋白酶
优先作用于Phe、Trp、Tyr等芳香族或具有大的疏水侧链基团的氨基酸羧基参与形成的肽键
胃蛋白酶
作用于断裂点残基的氨基侧(N)
化学断裂法
溴化氰,专一断裂Met羧基参与形成的肽键
通常获得的肽段比较大,对分子量大的蛋白质测序很重要
举例
胰岛素
链间二硫键、链内二硫键
牛胰核糖核酸酶A
二级结构
定义:肽链主链或称肽链骨架有规律的折叠和盘绕,是肽链局部的空间排列,不涉及侧链的构象和整个肽链空间排列
主要作用力是氢键
多肽链主链构象的空间限制
肽平面
定义:由于肽键的部分双键性质,所以肽键不能自由转动,使得参与肽键形成的四个原子及相邻的两个α-C处在一个平面上,称为肽平面
刚性平面
如果顺式构型,R基相互靠近不利于稳定,故蛋白质多肽链中肽键以反式构型为主
二面角Φ、Ψ
Φ
由N-Cα单键旋转产生的二面角,顺式时为0
Ψ
由Cα-C单键旋转产生的二面角,顺式时为0
不是任意二面角所决定的构象都是立体化学所允许的
肽链中主要为反式肽键,ω固定为180°
拉氏构象图
虚线以外——完全不允许区
实线以外虚线以内——部分允许区,可以存在但不稳定
类型
α-螺旋
基本结构特征(常考)
多肽链主链绕中心轴形成右手螺旋,螺旋每圈3.6个氨基酸残基
每圈螺旋沿中心轴上升0.54nm,每个氨基酸残基上升0.15nm,螺旋半径为0.23nm
α-C原子相邻的两个二面角Φ和φ均为定值
所有肽键都呈反式
氢键
稳定性主要靠肽键内氢键
氢键由多肽链中第n个氨基酸残基和C=O中的O与第n+4个氨基酸残基的-NH中的H形成
方向几乎与螺旋轴平行
每圈螺旋含3.6个氨基酸残基,氢键形成的封闭环中有13个原子
只要出现脯氨酸残基,α-螺旋即被终止
甘氨酸连续存在时,也不能形成α-螺旋
β-折叠
结构
肽链的主链伸展成锯齿状,叫单股β-折叠股,不同折叠股之间可以侧向并行排列
不同折叠股之间侧向并行排列,以氢键相连形成稳定片层结构,叫β-折叠片,2个氨基酸残基间的距离为0.325nm
β-折叠股的N-端和C-端交错位于折叠片的两侧,肽段从N-端到C-端的走向相反,形成的折叠片就是反平行的β-折叠片,2个氨基酸残基之间的距离为0.35nm
反平行的比平行的更稳定
同一折叠股中的R基团上下交替地分布于折叠片两侧
大量存在于丝心蛋白和β-角蛋白
脯氨酸不能参与氢键的形成,不利于β-折叠的形成
β-转角
肽链通过形成突环或回折的方式,连接这些规则的二级结构,实现肽链走向的转变,使肽链能够紧密折叠形成更高层次的结构
结构
少数几个氨基酸残基形成的突环结构称为转角,最常见的是β-转角
由4个连续的氨基酸残基组成,使肽链走向出现180°转弯,第1个氨基酸残基的羰基与下游第4个残基的氨基形成氢键
Ⅰ型,中间肽平面羰基与相邻的2个R基反方向排布
Ⅱ型,中间肽平面羰基与相邻的2个R基分布在同侧,造成较大的空间障碍
脯氨酸常出现在β-转角中,一般出现在第二个残基的位置
无规卷曲
没有规律性的主链骨架构象
仍具有特定构象,不是完全任意的,每一种蛋白质肽链中的无规则卷曲的空间构象几乎是特定的
超二级结构
概念:由相邻的蛋白质二级结构单元相互接近,形成由规律的二级结构聚集体,即相邻的两个或两个以上二级结构单元由连接多肽连接起来,组合成有特殊几何排列的局部空间结构
类型
αα
连续的2个反向平行的α螺旋相互缠绕形成的复绕螺旋,或称超螺旋结构
角蛋白中常见
ββ
又叫β-发夹,由两个反平行β-折叠股经转角相连
金黄色葡萄球菌核酸酶中有
βαβ
最常见的超二级结构形式
2个平行的β-折叠股通过2个小肽段连接在一个α-螺旋上
结构域
定义:较大的球形蛋白分子中,多肽链往往形成几个紧密的球状构象,这些球状构象称为结构域
一些酶的活性中心就位于结构域的缝隙中
类型
全α
全β
α/β
α+β
三级结构
概念:多肽链通过通过盘绕折叠,借助各种非共价键和二硫键形成的特定紧密球状构象
举例
肌红蛋白
解析方法
X射线晶体衍射技术(最主要)、核磁共振(NMR)、电镜三维重建
维持三级结构的作用力
疏水作用
突出作用
离子键
氢键
范德华作用
四级结构
概念:具有特定三级结构的肽链主要通过非共价键形成的大分子组合体系
亚基:四级结构中具有特定三级结构的肽链
纤维状蛋白质的结构
α-角蛋白
富含半胱氨酸,在二聚体的两条肽链之间形成许多二硫键,使其具有不溶于水和抗拉伸的特性
丝心蛋白及β-角蛋白
胶原蛋白
分离纯化技术
透析与超过滤
透析
原理:小分子物质能透过半透膜,蛋白质分子不能透过半透膜
超过滤
以一个压力差为推动力,促使蛋白质过膜
电泳
聚丙烯酰胺凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶
十二烷基硫酸钠,SDS,阴离子去污剂,使蛋白质变性
SDS-蛋白质复合物消除了由于天然蛋白质的电荷不同、形状不同而对电泳迁移率的影响,复合物在凝胶中的迁移率只取决于分子量的大小
等电聚焦电泳
根据样品等电点不同而使其在pH梯度中相互分离
蛋白质双向电泳
层析
凝胶过滤层析
离子交换层析
阳离子交换层析,填料带负电,蛋白质带正电
亲和层析
专一性可逆结合
超速离心
沉降系数:颗粒在单位离心力场中的沉降速度
一个S的单位为1×10^(-13)秒
常常直接用沉降系数S描述某些生物大分子或亚细胞器大小
生物质谱技术
小分子和大分子都可以研究
蛋白质的重要性质
胶体性质
胶体分散系统的3个条件
分散相质点大小介于1~100nm
分散相质点带有相同电荷,同种电荷相互排斥,使质点不易沉淀下来
溶剂在分散相质点表面形成溶剂化层,使分散质点间不易靠拢聚集成较大的颗粒而沉淀
蛋白质溶液
丁达尔效应
布朗运动
不能透过半透膜
蛋白质折叠时,具亲水侧链的氨基酸残基通常分布在表面,即表面分布着许多亲水基团
分子表面所带电荷可以吸附溶液中的反电荷离子,形成稳定的双电层
两性解离和等电点
等电点:在某一特定pH时,某一种蛋白质分子表面所带的正、负电荷数相等,即分子表面所带净电荷为0,分子表现出电中性,此特定pH值即是该蛋白质的等电点
等电点时蛋白质溶解度最低
沉淀
高浓度中性盐
盐析:大量盐离子“夺取”蛋白质分子表面的水分子,破坏蛋白质表面的水化层,使蛋白质溶解性降低而沉淀
盐溶:低浓度中性盐溶液使蛋白质分子可以吸附少量相反电荷的盐离子,起到稳定双电层的作用,增加蛋白质的溶解性
盐析不引起蛋白质变性,除盐后蛋白质可以重新溶解
有机溶剂
甲醇、乙醇、丙酮(-20℃不变性)
破坏蛋白质分子的水化层,使蛋白质脱水从而沉淀
降低蛋白质分子的介电常数,削弱蛋白质分子之间的斥力,降低蛋白质溶解度
重金属离子
当蛋白质分子带负电荷时,能与Cu2+,Hg2+,Pb2+,Cd2+,Ag2+,Zn2+等重金属离子结合形成不溶性重金属蛋白盐沉淀
发生重金属中毒后,及时服用蛋清、牛奶、豆浆等高蛋白物质
生物碱试剂
单宁酸
变性与复性
变性
当受到某些因素影响时,维系天然构象的次级键被破坏,蛋白质失去天然构象,导致生物活性丧失及相关物理、化学性质的改变
不涉及肽键的断裂,一级结构仍保持完整
因素
物理
加热
紫外线及X射线照射
高压
表面张力拉伸
化学
有机溶剂
脲、胍
酸碱
引起变性的化学因素也称为变性剂
表现
生物活性的丧失
一些侧链基团暴露
某些物理化学性质、生化性质的改变
复性
变性后的蛋白质在除去变性因素后,重新恢复天然构象和生物活性的过程
颜色反应
紫外吸收光谱
结构与功能的关系
一级结构与功能
变异与分子病
镰刀型细胞贫血病——β链N-端第6位氨基酸残基发生了置换,谷氨酸残基被置换成了非极性缬氨酸残基
序列比较
同源蛋白质:具有相同的祖先,具有相似的氨基酸序列,执行相似的功能
例:细胞色素
亲缘关系越近的物种,其Cyt c序列中氨基酸残基差异越小
其中有些氨基酸残基发生了变化,称为可变残基;有些残基不变,称为保守残基
空间结构与功能
牛胰核糖核酸酶A的折叠与去折叠
高浓度脲会破坏肽链中的次级键,巯基乙醇可以还原二硫键
实验表明当特定构象存在时,蛋白质表现出生物功能,尽管一级结构没有改变,蛋白质特定空间结构被破坏时,蛋白质生物学活性丧失
体内新生肽的折叠有特定酶参与
蛋白质二硫键异构酶
肽基脯氨酰异构酶
肌红蛋白、血红蛋白与氧的结合
别构效应:寡聚蛋白分子中亚基之间通过构象改变而实现的一种相互作用,表现在当分子中某一亚基结合效应物后,发生构象改变并引起其余亚基和整个分子构象的改变,从而带来寡聚蛋白质的性质和功能的改变
在肺部高氧分压环境中,血红蛋白的一个亚基与氧分子结合后产生构象改变,并引起其他亚基构象改变,加速与氧的结合
四级结构的血红蛋白所具有的别构效应是只有三级结构的肌红蛋白不具备的
朊病毒与构象病
朊病毒是一组至今不能查到含有任何核酸的侵染性加强的蛋白质颗粒
在人和动物中引起传染性海绵状脑病
蛋白质三级结构的预测简介
蛋白质组与蛋白质组学简介
蛋白质组
定义:一个基因所能表达额全套蛋白质
三种不同层次
细胞
组织
生物
细胞或组织或生物体在特定时间和空间上表达的全套蛋白质
蛋白质组学
以细胞内部全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象,对不同时间和空间上发挥功能的特定的蛋白质组群进行研究
研究手段
通过高通量二维双向电泳进行蛋白质分离
通过计算机软件进行图像分析
通过质谱技术及蛋白质信息处理技术对电泳中的蛋白质定性分析与鉴定
肽
肽键
一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基发生酰化反应,脱去一分子水形成的酰胺键称为肽键
命名
多肽链的方向是N-端到C-端
C-末端氨基酸残基仍称为氨基酸,其余氨基酸残基命名为酰胺
天然活性肽
定义:天然存在的多肽链可以由两个到几千个氨基酸残基组成,除了组成蛋白质的多肽链外,自然界中还存在着大量的肽类,具有各种特殊的生理活性,统称为天然活性肽
功能举例
催产素,九肽,由垂体后叶分泌,作用于子宫平滑肌及乳腺,在分娩时促进子宫收缩,哺乳期促进乳汁分泌
加压素,九肽,又称抗利尿激素,促进肾脏对水的重吸收,促进血管收缩增加血压
缬氨霉素,环肽,钾离子载体,干扰次级主动运输并抑制氧化磷酸化,影响细菌生长
类吗啡肽,镇痛,调节体温、心血管功能、呼吸功能,在体内释放后会被迅速降解,不会累积造成成瘾性
谷胱甘肽
结构
三肽
γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸
谷氨酸以γ羧基与半胱氨酸的α-氨基形成异肽键
半胱氨酸中的巯基易被氧化,使两个谷胱甘肽分子间形成二硫键,称为氧化型六肽
功能
容易发生氧化型和还原型之间额转变
氧化还原缓冲剂,抗氧化抗自由基
分类
简单蛋白质(7)
清蛋白
也称白蛋白
血液、淋巴、肌肉、蛋清、乳类、植物种子中都大量存在
球蛋白
谷蛋白
禾本科植物的种子
醇溶(谷)蛋白
含脯氨酸和酰胺较多
禾本科植物种子
精蛋白
相对分子质量小,没有特点空间结构
存在于精子
组蛋白
富含赖氨酸和精氨酸
存在于真核生物细胞核中
硬蛋白
结缔及保护功能的蛋白质
例如:角蛋白
结合蛋白质(8)
糖蛋白类
黏蛋白类
核蛋白类
脂蛋白类
磷蛋白类
金属蛋白类
血红素蛋白类
黄素蛋白类
蛋白质的功能和元素组成
主要生物功能
催化功能——酶
调节功能(包括激素)
运输——血红蛋白、血清蛋白、葡萄糖转运体
贮存——卵清蛋白、酪蛋白、铁蛋白
收缩及运动功能——肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白
结构支撑功能——角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白
保护及防御功能——免疫球蛋白、纤维蛋白原、抗冻蛋白、毒素蛋白
其他(奇异蛋白)——应乐果甜蛋白(对甜味受体有非常高的特异性,比同样分子数的蔗糖约甜100000倍)
元素组成
主要:碳氢氧氮硫
各种蛋白质中含氮量接近,约为16%
生物体内含量最丰富的分子,占细胞干重50%以上