导图社区 蛋白质的分离、纯化与结构分析
生物化学与分子生物学的蛋白质的分离、纯化与结构分析学习笔记总结归纳导图。包含蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离、偷袭和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物、层析分离蛋白质等，
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蛋白质的分离、纯化与结构分析
蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离
原因
溶液中一般含量较低，需要沉淀浓缩
有机溶剂沉淀蛋白质
操作
丙酮、乙醇等有机溶剂可以使蛋白质沉淀
再溶解在小体积溶剂中即可获得浓缩的蛋白质溶液
条件
0-4℃，沉淀后立即分离，10倍体积
盐析分离蛋白质
硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，表面电荷被中和以及水化膜被破坏而沉淀
不同蛋白盐析的盐浓度和pH不同
限制
初步分离（非纯品）
纯化后的蛋白长期放置在盐溶液中可析出形成整齐的结晶
免疫沉淀分离蛋白质
可用于特定蛋白质定性和定量分析
蛋白质具有抗原性
特异抗体识别相应抗原形成抗原抗体复合物
抗体与固相化的琼脂糖珠交联
易于获得抗原抗体复合物
抗原抗体复合物溶于含十二烷基硫酸钠和二巯基丙醇的缓冲液，加热
分离纯化抗原
透析和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物
优点
简便，回收率高
常用的浓缩方法
透析
利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法
透析袋
用具有超小微孔的膜制成，如硝酸纤维素膜
一般分子量10kD以下
如果袋外放置吸水剂如聚乙二醇可浓缩
作用
对盐析浓缩后的蛋白质溶液进行除盐
超滤法
用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜进行浓缩的方法
电泳分离蛋白质
蛋白质在高/低于pl的溶液中成为带电颗粒，在电场中能向正/负极方向移动
电泳
通过蛋白质在电场中泳动而达到分离的技术
纤维薄膜电泳
溶液点样于薄膜上，薄膜两端分别加正、负电极
带正电荷的蛋白质向负极
带负电荷的蛋白质向正极
带电多，分子量小的泳动快
带电少，分子量大的泳动慢
凝胶电泳
支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶
凝胶置于玻璃板上或管中，两端加上电极，混合液在凝胶中泳动
结束后用蛋白质显色剂显色，可见多条蛋白质色带
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
加入带负电荷较多的十二烷基硫酸钠SDS,使所有蛋白质表面覆盖一层SDS消除蛋白质间的电荷差异
泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关
聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应
等点聚焦电泳IEE
加入系列两性电解质载体，在电场中形成一个连续而稳定的线性pH梯度，即pH从凝胶的正极向负极依次递增
通过pI的差异而分离的方法
特点
蛋白质在偏离其pI的pH位置时带有电荷而移动
蛋白质在pl值相等的pH区域时，净电荷为零而不再移动
双向凝胶电泳2-DE
第一向是IEE
第二向为SDS-PAGE
利用pI和M的差异，在二维平面上分离
层析分离蛋白质
层析是分离、纯化蛋白质的重要手段
种类
离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等
离子交换层析和凝胶过滤应用最广
机理
分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷及亲和力等，使蛋白质在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相以达到分离
凝胶过滤/分子筛层析
层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成
溶液加于柱顶，小分子蛋白入孔内，因而在柱中滞留，大分子蛋白径直流出
亲和层析
蛋白质能与其相对应的化合物(称为配基)具有特异性结合的能力,即亲和力
蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离
既可分离纯化，也可测定蛋白质的分子量
在高达500000g的重力作用下，在溶液中沉降，直至其浮力与离心所产生的力相等，沉降停止得以分离
沉降系数S
蛋白质在离心力场中的沉降行为
密度和形状相关
蛋白质的—级结构分析
离子交换层析分析蛋白质的AA组分
首先分析已纯化蛋白的AA残基组成
蛋白质经HCl水解后成为个别AA
用离子交换树脂分开并测定各种氨基酸量
算出各AA在蛋白质中的百分组成或个数
测定多肽链的N-端和C-端的AA残基
第二步测定多肽链的N-端与C-端为何种AA残基
C-端
羧肽酶将水解进行鉴定
肼法
N-端
Sanger法（DNFB）
二硝基氟苯与多肽链的α-氨基作用生成二硝基苯AA
水解分离出带有二硝基苯基的AA
丹酰氯法
用丹酰氯生成丹酰衍生物，有强烈荧光可鉴别
Edman法
酶降解法(氨肽酶法)
肽链序列的测定
第三步是将肽链水解成片段，分别进行分析
方法
胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法、溴化氰法等
胰蛋白酶能水解Lyr或Arg的羧基所形成的肽键
胰凝乳蛋白酶水解芳香族AA羧基侧的肽键
溴化氰水解Cys羧基侧的肽键
肽段可通过层析和电泳及质谱进行分离纯化鉴定，得到的图谱称为肽图
可明确肽段的大小和数量
肽段的AA排列顺序一般采用Edman降解法分析
先与异硫氰酸苯酯反应
只与N-端的游离α-氨基作用
用冷稀酸处理，N-端残基即脱落，成为异硫氰酸苯酯衍生物
用层析鉴定
残留肽链继续与异硫氰酸苯酯作用，逐个鉴定
应用
蛋白质组学研究、生物制药产品的鉴定等仍需要进行高效而准确的蛋白质的部分一级结构分析
蛋白质的空间结构分析
圆二色光谱法/CD法测定蛋白质二级结构
CD谱对二级结构非常敏感
α-螺旋的CD峰有222nm，208nm的负峰和198nm的正峰等3个成分
β-折叠的CD谱不固定
测定含α-螺旋较多的蛋白质，结果更准确
蛋白质三维空间结构解析
X射线衍射和核磁共振NMR是经典方法
X射线衍射法
将蛋白质制备成晶体，X射线射至晶体上，产生不同方向的衍射，收集衍射光束所产生的电子密度图，计算出空间结构
核磁共振NMR
主要测定蛋白质的液相三维空间结构
冷冻电镜技术极大提高了蛋白质三维结构的解析速度和分辨率，可以分析蛋白质在相对天然状态下的结构，已是主要研究手段
生物信息学预测蛋白质空间结构
蛋白质空间结构的基础是一级结构
参照三维结构数据库可以初步预测各种蛋白质的三维空间结构
