导图社区 分子生物学技术知识汇总
一张思维导图带你了解常用分子生物学技术,包括分子杂交和印迹技术、PCR技术的原理与应用、DNA测序技术、生物芯片技术等。
编辑于2021-10-04 17:55:12常用的分子生物学技术
一 、分子杂交和印迹技术
1. 原理
分子杂交 (molecular hybridization)
不同单链核酸分子通过互补序列结合。
印迹 (blotting)
将待检测的生物大分子转移到固定基质上,再通过分子杂交,使其得到显现的过程。
DNA、RNA、蛋白质;应用最广泛
印迹技术
用各种物理方法使电泳凝胶中的生物大分子,如DNA、RNA或蛋白质等,转移并固定在NC膜上,膜上分子的位置与其在凝胶中的位置对应,形成印迹。
毛细管虹吸法
探针(probe)
是序列已知的、带有特殊可检测标记的单链核酸片段。用来检测不同来源的核酸样品中同源基因或者同源序列,以及基因的表达情况。
种类:根据来源
• DNA探针:长度在几百bp以上的基因组DNA或cDNA 片段。(选择基因的外显子区域,避免高度重复序列)
• RNA探针:RNA片段或体外克隆的cRNA单链。缺点:易降解。
• 寡核苷酸探针:人工合成的寡核苷酸片段。17-50核苷酸组成。优点:易获得、分子小,穿透性好。
核酸分子杂交原理
DNA片段按照电泳分离结果,特异性的转移到NC膜上,进行杂交反应。标记的探针如果与NC膜上的核酸序列互补,就可以结合到膜上相应的DNA或RNA区带,显影检判断膜上是否有互补的核酸分子
蛋白质印迹杂交
原理:基于抗原抗体之间的特异性结合。
将抗体偶联某种酶或者生物素------检测标记。
蛋白电泳(按分子量大小对蛋白进行分离)→转移到NC膜上→抗原抗体反应→显色
2. 类别及应用
DNA印迹(Southern Blotting) ——[Southern EM,1975]
DNA印迹实验
原理
DNA杂交的应用:DNA相关分析
1)克隆基因的酶切图谱分析;
2)基因组中某一基因的定性或定量分析
例子:苯丙酮酸尿症 ----苯丙酮酸羟化酶基因
3)基因突变分析
RNA印迹(Northern Blotting) ——[Alwine JC,et al,1977]
1977年,J.C.Alwine等人发展而来,是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行核酸杂交的一种实验方法
特异性强,假阳性率低,被认为是最可靠的mRNA或LncRNA\miRNA定性分析方法.---- 用于RNA的定性定量分析
Northern 印迹杂交
1、基本原理和基本过程与Southern blotting基本相同(电泳-转膜-杂交-显影)
2、待测样品为总RNA或mRNA
3、探针可用DNA或RNA片段
Northern印迹与Southern 印迹的异同点
1、基本原理和基本过程与Southern blotting基本相同(电泳-转膜-杂交-显影)
2、待测样品为总RNA或mRNA
3、探针可用DNA或RNA片段
4、不需要限制性内切酶消化
5、变性:RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂(甲醛、尿素、甲酰胺等)保持RNA处于变性状态,DNA电泳前和电泳中不变性, DNA转膜前需进行碱变性及中和处理
Northern杂交的应用-分析mRNA
1. 定性
2. 定量
蛋白质的印迹(Western Blotting) ——[Towbin H,et al,1979]
蛋白质经PAGE凝胶电泳后,也可以从胶中转移并固定到滤膜上,再与溶液中相应的蛋白质分子进行结合。然后用“抗原-抗体”免疫反应来鉴别滤膜上的蛋白质,也被称为免疫印迹。
相应于DNA的Southern blotting杂交技术和RNA的Northern blotting,蛋白印迹也被称为Western blotting
Western blotting一般流程
1. 蛋白样品的制备
2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
转膜(电场转移)
封闭
一抗杂交
洗涤
二抗杂交
洗涤
底物显色
Western blotting的应用
1)特异性蛋白质的定性分析
2)特异性蛋白质的半定量分析
3)蛋白质相互作用研究
原位杂交(ISH)
利用标记的核酸分子探针与组织、细胞或者染色体上待测的DNA或者RNA结合,经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或者染色体上的位置显示出来,称原位杂交。
优点:保持组织细胞的形态,不改变核酸在组织细胞内的定位;不需从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性。
细胞原位杂交、组织原位杂交
原位杂交必须具备3个重要条件
1. 组织、细胞或染色体的固定
2. 与待测片段互补的核酸序列(探针)
3. 与探针结合的标记物
特殊操作:
细胞或组织固定在玻片上
去垢剂(如Triton x-100和SDS)和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质,注意消化时间
加热使DNA变性(50-60度)
杂交体积小(10~20μl )
杂交时间(DNA探针杂交为2~4h,RNA探针杂交过夜;杂交前一般将组织切片置95 ℃ 5~15分钟使DNA变性,冲洗温度一般 不超过50 ℃)
防止脱片
显微镜下观察结果
1.DNA 荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)
探针:荧光素标记的DNA探针。
待检样品:组织、细胞、染色体上的DNA或者RNA。
用途
1,检测细胞内DNA或RNA是否存在特定序列。
2,外源性基因插入的检测
原位杂交,卫星DNA作为探针,检测染色体着丝粒
2. 确定基因在组织中的表达定位。
探针:RNA寡核苷酸探针。
待检样品:组织、细胞、染色体片子上的mRNA,tRNA,rRNA。
优点:特异性更强
用途:分析内源性基因,包括细胞内固有基因、异常基因和变异基因的表达变化。
斑点杂交(dot blotting)
在实验过程中,不经过电泳和转移,直接将变性的DNA点样到NC膜上,用已标记的探针进行杂交,洗膜后显影。判断是否有杂交以及杂交的强度.
二 、PCR技术的原理与应用
聚合酶链式反应 (The Polymerase Chain Reaction, PCR)
简称PCR,是一种在体外特异性扩增已知DNA片段的方法
模拟体内DNA复制的过程
一、PCR技术的原理
PCR的基本工作原理
(在体外模拟体内DNA复制的过程) 以拟扩增的DNA分子为模板,以两条人工合成的寡核苷酸片段为引物,两条引物分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合,提供3‘-OH末端; 在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。 不断重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增。
PCR体系基本组成成分
模板(template): DNA双链
引物(primer): 两条
是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。(上游引物&正向引物,下游引物&负向引物)
引物是PCR特异性反应的关键
原料(material): 四种dNTP
催化酶(enzyme): 耐热的DNA聚合酶
Mg2+缓冲液
基本反应过程
变性(94~96℃)
退火(50~65℃)
延伸(72℃)
理论上,目的片段以2^n递增(n为循环次数)
是不是循环数越多越好?
实际上,由于底物和引物的消化,酶活力下降等因素,扩增产物的增加,逐渐由指数形式变为线性形式
PCR反应优点
• 高效性
• 特异性
• 操作简单性
2-3小时可以把目的基因扩增数万倍
获得目的基因的首选方式
二、PCR技术的主要用途 利用PCR分析基因及其表达产物
(一)获得目的基因片段
快速获得已知序列目的基因片段的主要方法;首选方式
对同源未知序列的扩增
(二)DNA和RNA的微量分析
PCR技术敏感性高,对模板DNA的量要求很低,是DNA和RNA微量定性和定量分析的最好方法。
(三)DNA序列分析:高通量DNA测序的基础
(四)基因突变分析:结合测序或其他方法
(五)基因的体外突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行插入、嵌和、缺失、点突变等改造.
(突变位点设计在引物5’端. 为什么?)
三、几种重要的PCR衍生技术
1. 逆转录PCR技术
逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)是将RNA逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术
RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法
逆转录PCR技术常用引物
寡核苷酸dT
随机引物
特异性引物
逆转录PCR技术原理
首先以RNA为模板,在逆转录酶的作用下合成cDNA,再以cDNA为模板通过PCR反应来扩增目的基因。
2. 原位PCR技术
利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的基因片段
PCR反应在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行。反应后,再用特异性探针进行原位杂交即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在
原位PCR将目的基因的扩增与定位相结合,既能分辨鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置。
3. 实时PCR技术
实时PCR技术的定义
在PCR反应中加入荧光基团,利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,最后通过Ct值和标准曲线对未知模板的起始浓度进行定量分析的方法。
实时PCR分类
非探针类:SYBR Green
SYBR Green能结合到DNA双螺旋小沟区域
探针类: TaqMan, 分子信标, FRET(荧光共振能量转移)
实时PCR的应用
实时定量PCR技术具有定量、特异、灵敏和快速等特点,是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法,是DNA定量技术的一次飞跃。
实时PCR在肿瘤方面的应用
实时PCR用于多态性分析
实时PCR用于病原体的检测
三 、DNA测序技术 DNA sequencing
20世纪人类科学史上的三大创举
一、双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法
(一) Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基
原理
将一个 DNA 片段的 5' 端磷酸基作放射性标记,再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基,从而产生一系列长度不一而 5' 端被标记的 DNA 片段,这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离,再经放射线自显影,确定各片段末端碱基,从而得出目的 DNA 的碱基序列。
优点
1. 不需体外进行酶催化的延伸反应,未经克隆的待测DNA片段可以直接测序
2. 对于含有稀有碱基,或者G、C含量比较高的DNA片段、短链寡核苷酸片段的测定,优于Sanger法
(二)Sanger双脱氧链终止法利用2′,3 ′ -双脱氧核苷酸掺入终止聚合反应
弗雷德里克·桑格 ( 1918-2013)
1958年及1980年两度获得诺贝尔化学奖。
1955年将胰岛素的氨基酸序列完整地定序出来,同时证明蛋白质具有明确构造。
1975年时,发展出桑格测序法。
原理
核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸存在条件下复制或转录时,如果在四管反应系统中分别按比例引入四种放射性核素标记的双脱氧核苷酸,只要双脱氧核苷酸掺入链端,该链就停止延长,链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端,以双脱氧核苷酸为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个核苷酸),根据片段3’端的双脱氧核苷酸,便可依次阅读合成片段的核苷酸排列顺序。
二、第一代全自动激光荧光DNA测序仪器基于双脱氧法
基于Sanger法,采用四种荧光标记的ddNTP而不是放射性核素标记
待测DNA样品的4个反应产物在同一个泳道内依照片段大小电泳分离,由仪器自动连续采集荧光数据并完成分析,最后直接显示待测DNA的碱基序列
三、高通量DNA测序使基因测序走向医学实用
人群及个体进行全基因组序列分析必须实现DNA测序技术的微量、快速和低成本化
新的高通量DNA测序技术及其分析仪器因此应运而生。这些新技术被冠予新一代测序(next generation sequencing,NGS)之称
所有NGS都是在一次反应中同时分析多个DNA小片段
新一代测序技术
1. 焦磷酸测序(Pyrosequencing)
每一轮反应,每次只加入一种dNTP,
--- -配对,产生一个焦磷酸(PPi)
----不配对,dNTP降级,无信号
2. 循环芯片测序(cyclic-array sequencing)
可逆性终止反应
3. 单分子实时测序
三代测序
四、DNA序列分析的主要用途
1. 通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异
2. 通过DNA序列测定分析人工重组的基因
3. 通过DNA序列测定对定点突变进行确认
四 、生物芯片技术 Biochip Technologies
技术背景
• 随着人类基因组(测序)计划完成,越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定,基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。
• 怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。
• 建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。
基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot
Dot Blot
Macroarray
Microarray
一、基因芯片(gene chip)
是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)
类别
cDNA芯片
寡核苷酸芯片
应用-分析不同状态下的差异表达基因
特别适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达情况
其原理时是基于双色荧光探针杂交
二、蛋白质芯片(protein chip)
是将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上,当与待测蛋白质样品反应时,可捕获样品中的靶蛋白,再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术
1. 蛋白质检测芯片
2. 蛋白质功能芯片
作用原理-蛋白质分子间的亲和反应
抗原-抗体
受体-配体
三、组织芯片(tissue chip,tissue microarray)
是将数十个、数百个乃至上千个小的处于自然或病理状态下的组织标本集成在一张固相载体上(通常是载玻片) 形成微缩组织切片,以形态学为基础,在组织切片上高通量获取基因的表达信息的一种技术
1. 多组织片
2. 组织阵列
3. 组织微阵列
五 、蛋白质的分离、纯化与结构分析(不要求)
六 、生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study
一、蛋白质相互作用的研究技术
• 各种亲和分析(标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等)
(一)标签蛋白沉淀
标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。
系统构成
标签(GST,His)融合蛋白
待检测蛋白(纯化的或未纯化的)
可结合标签蛋白的琼脂糖珠
GST pull down 应用
• 验证两个已知蛋白的相互作用
• 分析两种分子结合的具体结构部位
• 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
(二)免疫共沉淀(CO-IP)
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
• 酵母双杂交技术
酵母双杂交技术是1989年由Fields等提出来的一种在真核模式生物酵母中进行的研究活细胞内蛋白质相互作用的遗传系统。
酵母转录激活因子GAL4分子 ----半乳糖苷酶基因gal1的转录激活基因
GAL4的结构
DNA结合区(BD)
促进转录的活性区(AD)
AD和BD分开后将丧失对下游基因表达的激活作用
在酵母双杂交系统中,“诱饵”蛋白X克隆至DNA-BD载体中,表达DNA-BD/X融合蛋白;待测试蛋白Y克隆至AD载体中,表达AD/Y融合蛋白。一旦X与Y蛋白间有相互作用,则DNA-BD和AD也随之被牵拉靠近,恢复行使功能,激活报告重组体中LacZ和HIS3基因的表达。
酵母双杂交系统的优点
• 高敏感性:检测的是基因表达产物的累积效应,弱的相互作用也能检测
• 真实性:一定程度上代表了细胞内真实的相互作用
酵母双杂交系统的应用
• 验证两个已知蛋白的相互作用
• 分析两种分子结合的具体结构部位
• 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
• 荧光共振能量转换效应分析
• 噬菌体显示系统筛选
二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术
• (一)酵母单杂交系统
• (二)电泳迁移率变动测定(EMSA)
或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)
用途
最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用。
也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。
是转录因子研究的经典方法
原理
DNA结合蛋白与特定DNA探针片段的结合会增大其分子量,在凝胶中的电泳速度慢于游离探针,即表现为条带相对滞后。 在实验中预先用放射性核素或生物素标记待检测的DNA探针,再将标记好的探针与细胞核提取物温育一定时间,使其形成DNA-蛋白质复合物,然后将温育后的反应液进行非变性(不加SDS,以免形成的复合物解离)聚丙烯凝胶酰胺电泳,最后用放射自显影等技术显示出标记DNA探针的条带位置。
• (三)染色质免疫共沉淀(ChIP)
是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。
ChIP-chip
ChIP与芯片技术结合在一起的技术。
在全基因组范围内筛选与特定蛋白质相结合的DNA序列。