5.分枝杆菌属

医学本科微生物学，枝杆菌属，知识梳理，仅供参考。主要包括概述和结核分枝杆菌(tubercle bacilli，TB)相关知识点。

分枝杆菌属(Mycobacterium)

• 概述
  • 一类细长略弯曲的杆菌，呈分枝状排列而得名
  • 根据其致病特点，大致可分为 结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌三类
  • 共同特性
    • 基因组中G+C 的百分比高，介千62 % - 70 %
    • 细胞壁中含有大量脂质（壁的60％，菌体干重的20％）
    • 抗酸杆菌(acid-fast bacilli )
    • 无鞭毛、无芽胞，也不产生内、外毒素， 脂质是其主要致病物质
    • 生长缓慢，代时为2~20 小时
    • 所致感染多为慢性感染过程， 可形成特征性的肉芽肿
• 结核分枝杆菌（tubercle bacilli，TB）
  • 概述
    • “结核分枝杆菌复合群 包括 4 种菌： 人、牛、鸟、鼠分别是结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌 牛分枝杆菌可致人类TB，约占6%-11% 非洲分枝杆菌是热带国家人类TB的病原体 田鼠分枝杆菌对人不致病
    • 结核分枝杆菌是人类结核病（ TB ）最常见的病原体，以肺部感染多见，飞沫传播
    • 结核病是目前全球尤其是发展中国家危害最为严重的慢性传染病之一，是全球前10 位致死病因之一，也是细菌性疾病致死的首位原因
  • 生物学性状 (奸懒馋丑)
    • 形态与染色
      • 细长略弯曲，大小约1 ~ 4μmx0. 4μm ， 呈单个、分枝状或团束状排列
      • 无鞭毛、无芽胞，有菌毛，微荚膜（电镜下可见）在静置培养状态下和感染机体内容易形成
      • 革兰阳性菌，但不易着色
        • 齐－尼抗酸染色
          • 以5 ％苯酚复红辅以加温方式使细菌着色，然后用3 ％盐酸乙醇脱色，再用亚甲蓝复染。结核分枝杆菌可抵抗盐酸酒精的脱色作用而染成红色， 而其他细菌及细胞被染成蓝色。 (革兰氏染色中的“鬼影”）
      • 细胞壁结构
        • 复杂，含有大量脂质
        • 脂质与阿拉伯糖和甘露糖结合成“糖脂 glycolipid
          • （与疏水屏障、抗药性和毒力密切相关）
        • 由内到外：肽聚糖-阿拉伯半乳聚糖-分枝菌酸组成复合物（mAGP）
        • 无磷壁酸，有“外膜层 ”（分内层和外层 ）
          • 内层
            • 分枝菌酸
          • 外层
            • 不同类型的糖脂如海藻糖6, 6' －二分枝菌酸( TDM) 和硫酸脑昔脂 ，或磷脂等形成脂质双层结构
          • 还有结合于细胞膜的脂甘露聚糖
    • 培养特性
      • 专性需氧菌，营养要求高，最适pH 为6. 5 - 6. 8
      • 生长缓慢， 约12~24 小时繁殖一代，接种后培养3 ~4 周才出现肉眼可见的菌落
      • 罗氏培养基
        • 
        • 菌落干燥不透明、坚硬， 表面呈颗粒状、乳酪色或黄色，形似菜花样
      • 在液体培养基中
        • 易形成有皱褶的菌膜 1~2w ）；若加入水溶性脂肪酸，有利细菌分散和做药敏试验
    • 生化反应
    • 抵抗力
      • 脂类含量高， 对某些理化因素的抵抗力较强
      • 干痰中可存活6~8 个月，附着于尘埃上，可保持传染性8~10 天
      • 四怕
        • 乙醇、湿热、紫外线和抗痨药物（链霉素、异烟肼、利福平等）
      • 四不怕
        • 干燥、酸、碱和青霉素等抗生素
    • 变异性
      • 形态变异
        • 呈颗粒状，串珠状， 短棒状，长丝形以及L型（过去称莫赫颗粒）
      • 菌落变异
        • R→S
      • 毒力变异
        • 在人工培养基上长期连续传代，其毒力可减弱
      • 耐药性变异
        • ？？？
  • 致病性
    • 致病物质
      • 无内毒素，外毒素和侵袭性酶类
      • 致病作用
        • 在细胞内寄居并大量繁殖
        • 菌体 脂质和蛋白质 成分及代谢产物的毒性
        • 机体产生的 迟发型超敏反应 所致的免疫病理损伤等有关
      • 脂质
        • 主要毒力因子，多呈糖脂或脂蛋白形式
        • 糖脂与C型凝集素受体(CLR) 结合 既具有佐剂活性、构成弗氏完全佐剂的重要部分，也是机体免疫反应的重要调节因素
        • 海藻糖6,6' －二分枝菌酸(TDM)——索状因子
          • 
          • 导致细菌在液体培养基中紧密黏成索状的物质
          • 重要的致病因子
          • 作用
            • TDM与巨噬细胞诱导型C型凝集素受体（ Mincle）结合，诱导抗炎细胞因子如I1和TNF-a的产生，促进肉芽肿形成。
            • 还可促进抗原提呈细胞成熟激活Th和Th7反应，具有佐剂特性
            • 但因细菌寄生在细胞内，相对于外环境胞内有丰富的葡萄糖，细菌会合成葡萄糖单分枝菌酸取代TDM, Mincle识别该物质的能力较弱，是细菌免疫逃避的一种策略。
            • 在潜伏感染状态下，细菌会优先合成甘油－单分枝菌酸，诱导Th2 型反应，从而有利千形成潜伏感染和细菌在入体内的长期存活
            • 破坏线粒体膜，影响细胞呼吸等
            • 还可能与菌体的抗酸染色性有关
        • 甘露糖脂
          • 包括脂阿拉伯甘露糖（LAM）、脂阿拉伯甘露聚糖（ ManLaM）和磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）
          • 帮助细菌进入细胞内，抑制吞噬体成熟，阻止巨噬细胞的杀伤，并诱导抗炎细胞因子如TNF-a的产生，导致机体发热、消瘦、体重下降和组织坏死
          • 与树突状细胞表面的 DC-SIGN结合，促进Ⅱ-10的表达，在感染早期可抑制致敏T细胞从淋巴结移行到肺脏的感染灶，有利于细菌在感染灶的繁殖
        • 硫酸脑苷脂
          • 可抑制吞噬细胞中的吞噬体与溶酶体融合，使结核分枝杆菌在细胞内存活
        • 磷脂
          • 能刺激单核细胞增生，促使病灶内的巨噬细胞转变为上皮样细胞而形成结核结节，并与干酪样坏死有关
        • 蜡质D（wax-D）
          • 细胞壁的主要成分
          • 能引发机体的IV 型超敏反应
          • 具有佐剂作用
      • 蛋白质
        • 多为脂蛋白或糖蛋白，致病作用较为广泛
        • ESX-1型分泌系统是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特有的Ⅶ型分泌系统
          • 培养滤过性蛋自（CFP-10）
          • 早期分泌抗原靶蛋白（ESAT-6）
          • 两者的复合物，与免疫逃逸和诱导超敏反应有关！
        • 结核菌素（ tuberculin）
          • 将细菌接种于液体培养基培养，收集培养滤液制备
          • 主要是细菌分泌的蛋白质且耐热的成分
          • 与具有佐剂活性的糖脂结合，能引起较强的迟发型超敏反应
      • 荚膜
        • 主要成分是多糖（ polysaccharide），与细菌黏附、抗吞噬、耐受酸碱等有关
        • 多糖还可使中性粒细胞增多、局部病灶细胞浸润等
      • 分枝杆菌生长素
        • 是一种铁螯合物，可与宿主竞争铁，故为一种毒力因子
    • 所致疾病
      • 
      • 人对结核分枝杆菌普遍易感，多数导致潜伏结核病感染，也可经消化道和破损的皮肤黏膜侵入；肺结核最常见！
      • 原发感染(primary infection)
        • 机体初次感染结核分枝杆菌， 多发生于儿童，常见于肺部
        • 传染源为活动性肺结核病人，经 飞沫 吸入 呼吸道
        • 到达肺泡后，主要被巨噬细胞吞噬，还可被树突状细胞、中性粒细胞、肺泡上皮细胞识别。 细菌通过自身毒力因素的作用，既能逃避吞噬细胞的杀伤，也能在巨噬细胞内存活并大量繁殖； 细胞死亡释放出的细菌在细胞外繁殖或再被细胞吞噬，反复发生上述过程，并引起渗出性炎症病灶，称为原发灶。
        • 原发综合症
          • 在X 线胸片中，原发病灶、淋巴管炎和淋巴结肿大显示哑铃状阴影
        • 原发结核病人的临床表现多不明显，少数可出现乏力、食欲下降、潮热和盗汗等
          • 大约3W 后，局部淋巴结中被激活的 T 细胞释放大量细胞因子（ IFN-γ 为主），新移行来的巨噬细胞促进杀灭细菌，形成细菌感染的巨噬细胞为中心，周围聚集泡沫状巨噬细胞、 T 、 B 淋巴细胞和成纤维细胞，最外层为胶原纤维包裹，即 慢性肉芽肿( tuberculosis granuloma ）；其中心包括死亡细胞和原菌的干酪样坏死，即 结核结节( tubercle ）。
        • 转归
          • 自愈
            • 随着抗结核免疫的建立，原发灶大多可纤维化和钙化而自愈
          • 播散
            • 少数感染者体内的细菌则通过淋巴、血流播散至全身，甚至导致“全身粟粒性结核”
          • 潜伏
            • 原发灶内可长期潜伏少量结核杆菌，形成“持留菌”或“休眠菌”，成为内源性感染的主要来源
      • 原发后感染(post-primary infection)
        • 多见于成人或较大的儿童，大多为内源性感染（复燃/再激活），少数是外源性
          • 在某些因素的作用下，如机体免疫力降低时，原发灶内潜伏的结核分枝杆菌大量生长繁殖，造成感染，称为复燃(recrudescence) 或再激活(reactivation).
        • 感染特点
          • 病灶局限
            • 一般不累及邻近的淋巴结
          • 病变发生迅速且剧烈
            • 迟发型超敏反应
            • 主要表现为慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，发生纤维化或干酪样坏死
          • X 线照片显示多样化
            • 
            • 增殖、浸润、干酪样坏死或空洞为主的多种改变
  • 免疫性
    • 固有免疫
      • 参与细胞
        • 巨噬细胞、 DC 、中性粒细胞、 NK
      • 机制
        • 胞通过表面模式识别受体( PRR) 识别细菌，PRR 激活后将不同信号传递到胞内，经级联放大，诱导细胞各种防御性固有免疫反应，如吞噬、自噬、凋亡和炎症小体的激活。
        • 另一方面，结核分枝杆菌也可通过自身的毒力抑制固有免疫应答，逃避固有免疫的杀伤
    • 适应性免疫
      • 机体感染结核分枝杆菌后虽然可产生多种抗体，但这些抗体一般没有保护作用。由于细菌的毒力，感染10天后结核分枝杆菌感染的树突状细胞才移行到局部淋巴结致敏T细胞，感染后约21天，被细菌抗原激活的CD4Th型细胞才归巢到肺部感染灶并建立针对该菌的细胞免疫。CDA·Th型细胞释放大量细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-2等，不仅能吸引T细胞和巨噬细胞等聚集到炎症部位，还能增强这类细胞的直接或间接的杀菌活性；此外，其产生的TNF-a可诱导细胞凋亡，促进肉芽肿形成，使感染局限化。因此，CD4+Thl型细胞在抗结核分枝杆菌感染中具有重要作用。CD8+T细胞可诱导感染的巨噬细胞裂解或凋亡，或产生颗粒溶素直接杀死细菌，还可分泌INy和TNF等细胞因子发挥抗菌作用，在阻止结核分枝杆菌潜伏感染的再激活过程中发挥重要作用。
      • 为兼性胞内寄生菌， 抗感染免疫主要依靠细胞免疫
      • 3 周左右才建立
      • Th1细胞 ：抗 MTb 感染具有重要作用
      • CTL：主要阻止潜伏感染的再激活。
    • 超敏反应
      • 为T细胞介导的迟发型超敏反应（IV型）
      • 形成以单核细胞浸润为主的炎症反应，容易发生干酪样坏死，甚至液化形成空洞
      • 常见于成人的原发后感染
    • 免疫与超敏反应的关系
      • 
  • 微生物学检查法
    • 标本
      • 痰液、中段尿液、粪便、脑脊液等
    • 浓缩集菌
      • 4%NaOH 处理 15min 后离心沉淀细菌，敏感性可以提高10 倍
    • 直接涂片染色检查
      • 抗酸染色 、或“ 金胺'O'染色”
    • 分离培养
      • 改良罗氏固体培养基
        • 培养基所含的孔雀绿可抑制杂菌生长
        • 37'C 培养4~8 周直至可见菌落生长
        • 敏感性可达80%~85%
      • BacterTB -460 系统
    • 动物试验
      • 常用豚鼠或地鼠
      • 常用豚鼠或地鼠，取浓缩集菌标本1ml ，腹股沟皮下注射3~4W 观察局部肿大的淋巴结，淋巴结切片可查见结核结节，结核菌素试验转为阳性
    • 药物敏感试验
      • 临床耐药株广泛流行，分离菌株都应进行药物敏感试验
    • 基因检测
      • 常用PCR 方法：10~100 个菌 /ml 即可检出，敏感性高；
      • WHO 推荐XpertMTB/RIF试验
        • 准确性高；检测快速；
        • 该方法以全自动半巢氏实时PCR 技术为基础，以rpoB 基因为靶基因，可在2 小时内同时检测结核分枝杆菌和利福平耐药
    • 免疫学检查
      • 结核菌素皮肤试验( TST)
        • 原理
          • IV 型超敏反应的体内试验
        • 方法
          • 取5 单位PPD 注入受试者左前臂掌侧前1/3 中央皮内， 72 小时(48~96 小时）后查验
        • 结果
          • 阳性
            • 红肿硬结直径 >5mm
              • 表示 BCG 接种成功，或已感染过结核杆菌，但不一定是结核病
          • 强阳性
            • 红肿硬结直径 >15 mm
              • 表示可能有活动性结核病 （尤其是婴儿）
          • 阴性
            • 红肿硬结直径 <5mm
              • 表示未感染过结核杆菌，但应排除感染初期或免疫力低下（如AIDS ）
      • IFN-γ 释放试验（ IGRA）
        • 以结核分枝杆菌与卡介苗的差异蛋白ESAT- 6 和CFP-10 多肤刺激致敏的T 淋巴细胞分泌IFN-γ，通过酶联免疫斑点试验( ELISPOT) 进行检测， 1 ~ 2 天即可获得结果
      • 抗体检测
        • 有供临床使用的试剂、但特异性还需进一步提高
  • 防治原则
    • 预防接种
      • BCG 是目前唯一批准使用的疫苗！
      • 卡介苗
        • 结核分枝杆菌的减毒活菌疫苗——H37Rv为标准毒力株
        • 结核菌素试验
          • 为接种卡介苗及测定免疫效果提供依据
      • 我国规定新生儿出生后即接种卡介苗一次
      • 卡介苗主要诱导产生CD4+ Thl 型免疫应答，而CD8+ T 细胞反应较弱，保护期10 ~ 1 5 年
      • WHO 和我国均不推荐复种
    • 治疗
      • “督导短程化疗”策略（ DOTS）
        • 五个基本要素
          • 尽早
            • 通过痰涂片镜检发现病人
          • 联合
            • 政府对结核病规划的承诺
          • 足量
            • 建立正规的药物供应系统
          • 规范
            • 建立对规划执行的监督、评价系统
          • 短程化疗
            • 在正确的管理下，给予标准的短程化疗
      • 分一线和二线药物