导图社区 DNA生物合成
《生物化学与分子生物学》第十四章 DNA 的生物合成笔记，包括DNA复制的基本特征、DNA复制的酶学和拓扑学变化、原核生物DNA复制过程等内容。
生化 关于信号转导的重点总结，注重图形讲解
生化 第十四章RNA的合成 真核生物，原核生物的RNA的合成特点归纳。包括：一、原核生物转录的模板和酶；二、原核生物的转录过程；三、真核生物RNA的合成；四、真核生物前体RNA的加工和降解。
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第14章DNA的生物合成读书笔记
DNA生物合成
DNA复制基本规律
半保留复制
DNA复制时，母链DNA解开为两股单链，每股单链各自做为模板按照碱基互补配对的规律，合成与母链互补的模板原料：dNTP DNA 引物 反应简式 （dNMP）n +dNTP→ （dNMP）n+1 + PPi
由于DNA复制遵循碱基互补的原则，按半保留复制的方式，子代可以准确保留亲代DNA的全部遗传信息，体现在代与代之间DNA碱基序列的一致性上
半不连续复制
DNA双螺旋的两股单链是反向平行的，当复制叉形成时，两条母链呈相反走向，其中一条是从5′~3′，另一条是从3′~5′，DNA复制的方式是均采用从5′~3′的走向，一条采用全保留复制，另一条采用半保留复制
前导链：DNA复制时，顺着解链方向生成的且复制时连续进行的是前导链
后随链：复制的方向与解链的方向相反，在延长的过程中不能沿解链方向连续合成，而是需要等待解链释放出足够长的一段模板，才能合成一段子链的称为后随链
后随链中的不连续片段称为冈崎片段
后随链的合成晚于前导链
双向复制
从一个复制起点向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉
复制叉：DNA解链时双链分成两股，各自做为模板，子链沿模板延长所形成的Y字形的分叉
复制子：含有一个复制起始点的独立完成复制的功能单位（原核生物整个环形DNA为一个复制子
高保真性
半保留复制 碱基互补配对 体内复制叉的复杂结构 DNA聚合酶的外切酶活性和校读功能和复制后的修复系统
原核生物DNA的复制 单起点双向复制
原核生物复制的起始
DNA解链
大肠杆菌复制起始点oriC
3组串联重复序列
富含AT（只有两个氢键维持，易解旋）
作为解链区
位于上游
2组反向回文序列
富含CG
作为识别区
位于下游
SV40病毒
两组反向回文序列
富含AT区
大肠杆菌复制起始的相关酶
DnaA——识别并结合于oriC的串联重复序列DNA启动子区
DnaB——解旋酶
DnaC——介导DnaB与DNA结合
参与解旋
DnaG——引物酶
SSB——单链结合蛋白， 维持单链结合到游离单链上，一定时间内使复制叉保持适当的长度，有利于核苷酸依据模板参入
拓扑异构酶II——将下游过度缠结的DNA解开，使得缠绕被消除
引发体和引物
引物：由于DNA聚合酶不能连接dNTP与dNTP，只能催化已有核酸片段的3′末端与dNTP连接，所以需要先合成一端由引物酶（属于RNA聚合酶，但不同于转录时的RNA聚合酶）合成的短链RNA
引发体：DNA复制起始点已经完成解链，此时引物酶进入，形成含有DnaB，DnaC，引物酶和DNA复制起始区域的复合结构
引发体在DNA链上移动，需要ATP提供能量
原核生物复制的延长
DNA pol I polA编码
作用
对复制中的错误进行校对
对复制和修复中的空隙进行填补
外切酶活性切除冈崎片段合成后切除引物，并合成对应的DNA链
组成
小片段
具有5'~3'核酸外切酶活性，切除引物所需
大片段（Klenow片段）
具有3′~5′核酸外切酶活性，校读功能 切除错误的DNA序列
具有5'~3'DNA聚合酶活性
DNA校读的过程
DNA pol III polC编码
作用：主要发挥作用的DNA聚合酶 原核生物复制延长真正起催化作用的酶
α：5'~3'聚合酶
ε：校读功能，3'~5'外切酶活性
γ：核心酶的组装，增强其活性
β：夹子结构，可以固定住DNApol，使酶沿DNA移动
概要
DNA pol II 其相关基因发生突变， 细菌依旧可以存活
作用：参与DNA应急修复
对DNA的特异性要求不高，即使在损伤的DNA上也能完成复制
三种酶都具有聚合，外切酶活性
后随链模板DNA可以折叠或绕成环状，由于后随链做360度绕转，所以前导链和后随链的生长点都处在DNA pol III核心酶的催化位点上
引物的去除与填补：DNA pol I与DNA连接酶
原核生物复制的终止
切除引物，填补空缺 —DNApol1
连接切口—DNA连接酶
真核生物DNA生物合成的过程 多起点，双向复制（多复制子复制）
真核生物复制起始
复制起始点比大肠杆菌OriC短，酵母复制起始点含有11bp的自主复制序列ARS
复制子多，时序性启动 而不是同步启动——故其引物，冈崎片段较原核生物短
需要的聚合酶
DNA pol α
引物酶
5'~3'聚合酶活性
DNA pol β
低保真度复制
DNA pol γ
线粒体DNA复制
DNA pol δ 负责后随链
解旋酶
5'~3'聚合酶活性高
主要参与DNA的合成
3'~5'核酸外切酶活性
DNA pol ε 负责前导链
与DNA pol I功能类似，具有校读和填补修复缺陷的功能
需要的其他酶类
PCNA 增殖细胞核抗原
与β夹子类似，固定DNA pol δ到DNA上
为同源三聚体
使DNA pol δ获得持续合成的能力促进核小体生成，检测细胞增殖的重要指标
RFA
功能类似SSB
RFC
功能类似于γ复合物
拓扑异构酶
真核生物复制延长
先由DNA pol α合成一端引物，再由PCNA将 DNA pol δ固定到DNA上，逐步替代DNA pol α
后随链中DNA pol α与DNA pol δ之间会进行不断的转换
引物引发的频率使相当高的，故DNA pol α与DNA pol δ的转化频率也使相当高
引物的切除与填补
Dna2/FEN1
FEN1发挥核酸内切酶活性
Dna2解旋
RNase/FEN1
RNase发挥核酸外切酶活性
FEN1发挥5'~3'核酸外切酶活性切除最后一个RNA与DNA之间的连接
冈崎片段的长度与一个或若干个核小体上的DNA链长度类似
真核生物酶催化速率较原核生物慢，但是由于多个复制起始点，所以整体速度并不慢
真核生物合成以后立即与组蛋白结合形成核小体
复制叉的和移动会使核小体被破坏，但随着复制叉的向前移动，核小体在子链上又会快速合成
真核生物复制的终止以及端粒酶DNA的合成
端粒：真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。形态上由于DNA及其结合蛋白紧密结合而膨大成粒状
端粒结构使富含T-G短序列的多次重复人类端粒由TTAGGG重复单位构成，长度为5~15kb
端粒酶构成
端粒酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能
HTR：人端粒酶RNA
HTP1：人端粒酶协同蛋白
HTRT：人端粒酶逆转录酶
爬行模型
端粒酶识别并结合到DNA母链的重复序列上，以RNA为模板通过逆转录的方式延伸母链
延伸至一定长度之后以DNA pol取代端粒酶，母链翻折形成一端发夹结构并作为模板和引物完成末端双链的合成
真核生物复制的调控机制
特征：在一个细胞周期内，只有S期有且仅有一次DNA复制
复制调控主要出现在G1-S期和G2-M期
复制基因的选择
出现于G1期
每个复制基因位点均组装前复制复合物
起始点识别复合物ORC结合到复制基因位点
招募解旋酶装载蛋白Cdc6和Cdt1，进而招募解旋酶Mcm2-7组装成前复制复合物
复制起点的激活
发生于进入S期之后
Pre-RC激活
Cdk磷酸化Cdc6、Cdt1，使之被降解
Cdk活性在G1期很低，保证DNA复制仅发生在S期
Ddk磷酸化Mcm，促进其解旋酶活性
招募DNA复制相关蛋白和聚合酶，启动复制
逆转录和其他复制方式
逆转录
逆转录酶
RNA指导的DNA聚合酶活性
DNA指导的DNA聚合酶活性
RNase活性
核酸内切酶（部分将自身插入到宿主核DNA中去的病毒）
引物：赖氨酸tRNA
不具有3'~5'核酸外切酶活性，没有校读功能，DNA出错率较高
逆转录酶应用：cDNA法
逆转录酶将一段RNA逆转录成RNA/DNA杂交双链
随后用酶或碱将RNA除去
剩下的单链DNA通过Klenow片段完成双链DNA的合成，合成的DNA称为cDNA
D环复制
线粒体DNA复制形式
复制起点不在同一位置，有先后顺序
DNA pol γ是催化线粒体DNA合成的聚合酶
滚环复制机制
φX174
单链DNA病毒，在核内的繁殖方式为双链DNA
受到具有核酸内切酶作用的蛋白A剪切
感染大肠杆菌的M13噬菌体也是滚环复制
DNA损伤与修复
DNA损伤的类型
外界因素
物理因素
紫外线：形成嘧啶二聚体（或环丁基环）
各种辐射
化学因素
碱基类似物
5-氟尿嘧啶/5-氟溴嘧啶 ——胸腺嘧啶类似物——阻碍dTMP以及RNA的合成
体内因素
DNA复制错误
DNA的自身不稳定性 在DNA自发性损伤中，最频繁的一种
生物因素
病毒和霉菌
黄曲霉素损伤DNA，致癌 是对人类健康危害极为突出的一种霉菌毒素
错配
亚硝酸盐使得C脱氨基变为U，导致C-G变为A-T
缺失和插入
烷化剂可以使G的7号位N甲基化，从而导致G脱落从而导致移码突变
重组或重排
DNA内较大的片段交换
DNA损伤结果
复制或转录暂停（DNA切断或嘧啶二聚体）
复制后基因突变
DNA修复方式
错配修复
对复制和重组中碱基错配，缺失和插入进行修复
大肠杆菌错配修复
MutS负责识别因为错配造成的DNA形变，进而招募MutL和MutH
MutH行使核酸内切酶功能，在错配位点附近剪出一个缺口，核酸外切酶水解一段子链，再由DNA聚合酶和DNA连接酶完成修复
识别子链的方式，母链有GATC的A甲基化
直接修复
光修复系统
光修复酶在光照条件下激活，参与修复嘧啶二聚体
烷化碱基的修复
烷基转移酶介导烷化碱基脱烷基，自身也会失活
无嘌呤位点的修复
DNA链上碱基受损后会被DNA N-糖苷酶水解，随后在DNA嘌呤插入酶作用下直接插入碱基从而修复损伤
单链断裂的修复
DNA连接酶直接在断链处连接
切除修复 最普遍的DNA损伤修复方式
传染病着色性干皮症（XP）：DNA损伤核苷酸切除修复系统基因缺陷 故不能修复被阳光照射的皮肤细胞
碱基切除修复
DNA N-糖苷酶将错配碱基水解掉，生成了一个无嘌呤/嘧啶的位点
核酸内切酶识别该位点并将该磷酸核糖水解掉
DNA解旋酶协助
DNA聚合酶和DNA连接酶将空缺位点填补
核苷酸切除修复
识别的不是具体的损伤，而是损伤所造成的DNA双螺旋结构的扭曲
由一个酶系统识别扭曲的双螺旋结构
核酸内切酶在损伤部位两端各剪开一个切口
在DNA聚合酶和DNA连接酶作用下重新修复
参与转录偶联修复
在DNA转录时，参与切除修复的酶募集于RNA聚合酶附近，对于损伤进行尽快修复
RNA聚合酶是一种损伤传感蛋白
着色性干皮病：DNA损伤切除机制缺陷
重组修复 当DNA损伤严重时
跨损伤重组修复 一种错误倾向性的DNA损伤修复
DNA聚合酶在损伤处停止修复，在后面继续复制，留下了一段缺口
大肠杆菌重组修复
重组蛋白RecA将另一段母链与缺口部分进行交换（并不能真正解决问题）
合成跨越损伤修复——母链上的缺口由以其自身为模板，在聚合酶和连接酶作用下合成随机的碱基序列（SOS反应）
非同源末端连接的重组修复
哺乳动物DNA双链断裂后的一种修复机制
断裂的两个DNA分子末端不需要同源性就可以拼接起来
DNA-PK介导断链的重接
虽然会产生错误，但是如果错误发生在非必需基因上，仍能维持细胞存活
也是一种生理性策略，通过该方法产生新的组合，比如免疫球蛋白的构建与重排
同源重组修复
参与重组的两段DNA具有同源性，有相当长的序列（大于等于200bp）相同
大肠埃希菌
断裂末端被RecBCD所识别，其本身具有3'~5'核酸外切酶的活性，水解掉一段DNA序列
RecBCD遇到chi位点时停止水解，RedD解离
RecBC发挥解旋酶活性，使得一段序列被游离出来
游离的DNA序列被RecA结合，RecA识别一段同源序列，引导DNA序列侵入姐妹DNA双链中，修复断裂的DNA双链
该修复过程具有较高的忠实度
SOS修复
DNA损伤广泛难以继续复制时，开启紧急修复系统
DNA聚合酶III无法进行扩损伤复制时，应激产生DNA聚合酶IV和V会替代III，在子链中随机插入核酸使复制继续
复制的出错率高，导致长期广泛突变
原核生物SOS修复的开启依赖于LexA和RecA的共同作用，DNA损伤严重时，阻遏蛋白LexA在RecA的作用下自水解，形成整体动员
有些致癌剂能诱发SOS修复
哺乳动物也有SOS修复过程
DNA分子的拓扑学 解螺旋并维持单链 （DAN边解旋边复制，贯穿始终）
子主题
DNA拓扑异构酶
拓扑酶1
切断DNA中的一股，使DNA变为松弛状态，适当的时候又将切口封闭 无需ATP
拓扑酶2
切断超螺旋的两段，使DNA松弛 ；然后在ATP的供能下又连接起来
依赖RNA的DNA聚合酶
