口腔疾病分子生物学

口腔疾病分子生物学导图笔记，讲述了分子生物学、基因编辑技术、特意核酸的检测、遗传疾病的分类、基因多态性与突变等。

口腔疾分子生物学5

• 分子生物学basis
  • 1.❤基因gene
    • （1）真核基因结构：
      • ①内含子intron：插入序列，位于基因的内部，是能够被转录的一段DNA，但在转录之后，与之相应的那部分的转录产物在剪接中被去掉了 外显子exon：基因中与成熟的mRNA相对应的DNA片段，它包括蛋白质编码的部分及5'和3'末端不翻译的侧翼序列 ②promotor启动子：基因转录起始点上游100-200bp内的转录调控序列，结合RNA聚合酶并启动转录：TATA box--准确定位；CAAT box--定量高效转录；GC box--CAAT两侧，结合SP1，激活转录 ③enhancer增强子❤：启动子上游或下游的一段DNA序列，增强基因的转录，不受距离影响，序列颠倒仍起作用 ④沉默子：负调控顺式元件，使基因转录或关闭。不受序列方向，距离影响 ⑤terminator终止子：由一段回文序列和特定的5'-AATAAA-3'序列组成
    • （2）基因功能
      • 编码蛋白发挥功能--选择性剪接alternative splicing：RNA序列中出现多种不同剪接信号时，同一个前体mRNA可以以不同的剪接方式产生多种mRNA，翻译出多个不同的蛋白质
    • （3）基因与基因组
      • 重叠基因overlapping gene：两个或以上基因共用一段重叠的核苷酸序列 重叠方式--①大基因之内包含小基因 ②两基因前后首尾重叠 ③3个基因的三重重叠 ④反向重叠
      • 基因家族gene family：一个祖先基因经过重复和变异而产生的的一组基因组成，基因家族的成员可以集中成簇的分布在某染色体上的特殊区域，称基因簇gene cluster
  • 2.基因表达
    • RNA的生物合成--转录❤
      • 转录的模板和方向：sense strand(3→5）和非模板链antisense strand 转录方向：5-3'
      • RNA polymerase和promotor：细菌启动子位于-10区的TATAAT；-35区的TTGACA
      • 转录的起始和延伸： ❤转录后修饰！！5’-m7G；3'-poly(A）
        • （1）加帽：转录物5'端去磷酸化，在鸟苷酸转移酶作用下通过5'-5'共价键加上一个G残基，被甲基化后形成m7G--保护5'端不受核糖核苷酸降解，并在蛋白质合成中起起始作用 （2）RNA剪接：去除内含子（U开始，AG结束）,反式剪接 （3）加尾：3'端在腺苷酸聚合酶作用下，多聚腺苷酸化+多聚腺苷酸尾（200个），形成polyA尾--促mRNA从核到质的搬运和保护3'端免降解 加帽加尾同时进行
      • 讨论转录的过程
    • 蛋白质的生物合成--翻译
      • 1.遗传密码：性质①所有的密码都是由3个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔的核苷酸存在 ②64个密码子中3个是终止密码（UAA,UGA,UAG）,AUG为起始密码子 ③密码子具有简并性（除色氨酸和甲硫氨酸仅一个密码） ④密码子具有通用性
      • 2.synthetic process of protein
        • 氨基酸的活化；蛋白质合成的起始；肽链的形成和延伸；合成的终止
      • 3.新生多肽的加工
  • 3.regulation of 基因表达
    • 乳糖操纵子模型lac operon model：启动子Pi+调节基因i+半乳糖苷酶启动子P+操纵基因O＋结构基因Z=operon 半乳糖苷酶启动子，无乳糖，结构基因关闭；乳糖可结合阻遏蛋白repressor β-半乳糖苷酶；半乳糖苷通透酶；半乳糖苷乙酰化酶 负调控：无调控蛋白时，结构基因开启，调控蛋白出现结构基因被关闭 lac 正调控-阿拉伯糖操纵子
• basic tools and techniques
  • 分子克隆的材料和方法
    • molecular cloning process
      • ①基因文库建立 ②目的基因筛选 ③目的基因分析
        • ①分离目的基因 ②切割目的基因和载体 ③目的基因和载体的连接 ④重组DNA转化宿主细胞 ⑤阳性克隆的筛选 ⑥DNA测序分析
    • restriction endonuclease：一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，需要辅助因子（Mg2+），根据识别序列的差别分为I,II,III型（主要2型）
      • why main 2型？ ①有特定的识别序列，通常为4-6个碱基对 ②切割点位于识别序列内的固定位置上，DNA被切割后，其5'端有磷酸基团，3'端有羟基基团 ③酶切后形成黏性末端或平齐末端
    • DNA ligase：常见有T4 DNA连接酶和大肠杆菌连接酶--形成磷酸二酯键
    • plasmid❤：是一种细菌细胞内独立于染色体外的环状DNA，它具有自我复制能力，在细胞分裂时可伴随染色体分配至子细胞中
      • 质粒构成❤：①ori区，质粒复制的起点 ②par区，保证分裂过程中质粒被均等的分配到子细胞 ③多克隆区，人为构建，包含多个单一限制酶酶切点，便于在此处切开质粒并加入外源DNA ④选择因子，常含耐抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因
        • ❤质粒特点，构成及应用
    • bacteriophage噬菌体------------------噬菌斑plague：噬菌体感染细菌后导致细菌细胞破裂、死亡，若是在琼脂平板上感染生长着的细菌，可形成细菌破裂后遗留的空斑
    • 转化transformation：受体菌捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程 转染transfection：专指受体菌捕获和表达噬菌体DNA分子的过程--裸DNA直接接触感受态细胞 转导transduction：噬菌体感染感受态细胞，利用噬菌体为媒介，将源DNA转移至受体菌并获得表达
  • 特异核酸的检测
    • 核酸分子杂交：原理--特定的同源区根据碱基互补配对原则形成双链 类型：dotting hybridization 和 Southern hybridization
    • 聚合酶链反应polymerase chain reaction
      • definition：通过酶促反应在体外扩增特异DNA片段的一种方法，具有快速，简便，灵敏，省时，对产品纯度要求不高等特点
      • principle原理/步骤：principle-利用DNA复制的原理，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成 procedure：①DNA变性：通过加热使靶DNA双链解离成两条单链 ②引物与靶DNA退火：降低温度至适当水平，促使两个引物根据碱基互补配对原理分别结合至靶DNA的两条链的3'末端 ③引物延伸：在DNA聚合酶催化下，引物沿着靶DNA3'末端向5'末端延伸（引物延伸方向5'-3')靶DNA数量呈指数增加，25-30次循环则达理论10*9，实际10*5-10*7
      • 影响PCR的相关因素：①DNA聚合酶：热稳定性；高特异性；适宜较长DNA片段的扩增 ②模板 ③引物 ④底物浓度 ⑤温度 ⑥循环次数
      • application：分离已知基因；检测微量DNA；遗传性疾病，肿瘤的诊断
  • 基因编辑技术
    • genome editing：内切酶切割特定基因，借双链断裂激活NHEJ和HR修复机制从而改变基因。 最为常用--CRISPR/Cas9 系统❤ 类似哺乳动物二次免疫原理
      • principle：
  • 基因表达的操纵
    • 增加基因表达水平：根据基因转入细胞的方式分为质粒介导和病毒介导
    • 降低基因表达水平：用genome editing破坏exon--基因敲除；短时间降低采用RNAi的方法
• Molecular mechanism of odontogenesis
  • of enamel
    • 外胚层上皮形成唇板，唇板朝龈面形成牙板，10w牙板内侧形成成釉器，下方是外配间充质形成的牙乳头，周围是外胚间充质形成的牙囊
    • 1.发育分期
      • 顺序-前成釉细胞的分化→前成牙本质细胞和成牙本质细胞的分化→牙本质的形成→成釉细胞的分化→牙釉质的形成 secretory stage：crown特定区域成釉细胞分泌釉基质开始至结束-深面矿化较高 maturation stage：牙釉质分泌结束至牙萌出，主要进行釉质矿化 釉基质（疏水性和酸性分）amelogenin（疏水性）；enamelin（酸性）；ameloblastin and tuftelin
    • 2.釉基质enamel matrix的特征（疏水性→亲水性）：
      • ①amelogenin：main of matrix；控制基因为AMEL基因；牙特异性基因，在前成釉细胞，成釉细胞，上皮根鞘剩余中表达；位于X染色体上；与X连锁的牙釉质发育不全相关 ②enamelin：earlist secreted 编码基因为ENAM基因 ③ameloblastin：分子量较小N端（逐步降解不消失），较大C端（迅速降解消失）；N端位于各层。编码基因为AMBN基因；成釉细胞高表达，Hertwig上皮根鞘和牙源性肿瘤中度表达 ④tuftelin：酸性蛋白质，先于amelogenin表达 ⑤蛋白水解酶：基质金属蛋白酶20（MMP20）和丝蛋白酶
    • 3.釉基质蛋白在牙釉质发育中的作用：
      • ①启动牙釉质矿化（可与矿物质结合，参与矿化核晶的形成和釉基质中矿物盐的储库） ②作为晶体生长的支持相（釉原蛋白） ③调节晶体生长（水解酶MMP20选择性加工--分泌期和成熟期早期；丝蛋白酶无选择性分解--迅速矿化--成熟期）
  • of dentin
    • predentin：成牙本质细胞最初分泌的非矿化的蛋白基质
    • dentinal ECM成分及分类
      • 无机物(mainHA)70%；有机物(collagen90%，non-collagenous proteins10%)18%；水12%； 牙本质NCPs--成牙本质细胞源性：①牙本质磷蛋白和牙本质涎蛋白 ②非成牙本质细胞源性：矿化组织中的蛋白：牙本质基质蛋白1，骨涎蛋白；骨钙素 ③多组织非特异性蛋白：骨桥素，糖胺多糖
    • collagen：新生牙本质中，I型collagen以5型collagen为核心交联成网状
    • dentin中NCPs
      • 1.dentin phosphoproteins DPP：占NCPs的50%，富含天冬氨酸和磷酸化的丝氨酸，后者更多，显著特征：高度磷酸化（人体中磷酸化程度最高蛋白），酸性最强蛋白质之一，强阴离子特性；亲钙；双重作用：促进和抑制矿化；亲I型胶原和亲钙； 2.dentin sialoprotein DSP：成牙本质细胞和前成釉细胞均可合成；可促HA生长 3.关系：DSP与DPP是DSPP基因编码的单一转录物的表达产物
    • 矿化组织中protein
      • 1.dentin matrix protein1 DMP1：牙本质和骨组织中高度表达，酸性程度很高，特殊RGD序列-结合成骨破骨细胞，调节靶细胞功能 2.bone sialoprotein：高度糖基化蛋白，谷氨酸，天冬氨酸丰富；一个RGD序列；两处多个谷氨酸组成区域（吸附Ca和HA） 3.osteocalcin OC：抑制晶体生长，调节晶体生长速度和方向
    • 多组织非特异性蛋白
      • 1.proteoglycans PGs:主要为硫酸软骨素，防止predentin过早矿化 2.osteopontin OPN：信号传递，调节矿化晶体生长和形态，为抑制因子
  • 不能使用
• Application of molecular biology in the study of oral pathogens
  • 变异链球菌属致龋毒力因子
    • 葡糖基转移酶：mutans有三种：GTF-I;S;SI(分别由gtfB,D,C基因控制) gtf基因特点：1.基因4000-5000个碱基 2.GTF氨基端具有30个AA的信号肽 3.信号肽后200-300个AA段为variable region-GTF酶催化段 4.进化不活跃段，conservative region，GTF羧基段，葡聚糖结合区glucan binding domain
      • GTF-I 非水溶性--与mutans粘附正相关 但过多，或过少时，粘附能力均下降
    • other介导mutans粘附因子：①葡聚糖结合蛋白GBP ②果糖基转移酶FTF和果聚糖酶Fru ③表面蛋白I/II；或PAc或SPa--疏水性
    • mutans致龋的毒力因子：GTF-I;GTF-SI;细胞内多糖合成酶
  • 基于核酸序列分析的 oral microorganisms 分类和鉴定
    • 16S rRNA基因测序-适合PCR扩增，克隆和测序
• 口腔遗传学生物学基础
  • 遗传疾病的分类
    • ①染色体病chromosome disorders--染色体结构数目异常 ②单基因病single gene disorders--由单个基因突变引起，遗传方式符合孟德尔遗传法则的疾病 ③多基因病polygenic disorders--微效基因作用累加，受环境因素影响较大的多种复杂因素共同作用引起的疾病 ④线粒体病mitochondrial genic disorders--线粒体基因的改变 ⑤体细胞遗传病somatic cell genetic disorders--体细胞遗传物质的改变
  • 单基因遗传病中重要definition
    • 1.外显率penetrance：在一个群体中带有某一致病基因的个体表现出相应疾病表型的比率，一般百分率表示
    • 2.表现度expressivity：基因决定的某一性状或疾病在个体中的表现程度。同一家系成员，同一个位点突变但疾病的表现程度不同。--颅骨锁骨发育不全CCD
    • 3.遗传异质性genetic heterogeneity：某一性状或疾病可由多个不同的基因所控制 基因多效性pleiotropy：和遗传异质性相反，是指同一个基因的突变可引起不同的疾病
    • 4.拟表型phenocopy：由于环境因素的作用所产生的的疾病或表型与某一特定基因突变所产生的表型相同或相似的现象
    • 5.同一基因突变呈现显性和隐形遗传
  • 基因多态性与突变
    • 单核苷酸多态性：SNP和cSNP（synonymous70-80% 和nonsynonymous）
    • 拷贝数变异copy number variation
    • 缺失deletion和插入insertion
    • 4.点突变point mutation：单个base置换；transition-不同嘌呤间或嘧啶间的相互置换；；transversion-嘌呤与嘧啶间的置换 ①same sense mutation-碱基替换后一个密码子变成另一个密码子，但编码的氨基酸为同一种，实际上未发生多肽序列的改变/silent mutation ②missense mutation：碱基替换后形成新的密码子，编码的氨基酸发生改变，可能影响基因产物的功能-保守性替换和非保守性替换 ③nonsense mutation：一个编码氨基酸的密码子，在点突变后变成了一个终止密码子，使多肽合成提前终止，产生了缺失原有羧基端片段的截短了的肽链
    • 5.移码突变 frameshift mutation：基因的编码序列中发生核苷酸增加或缺失的突变，使处在突变发生位置下游的密码子组成发生改变，从而造成移码突变 整码突变in-frame mutation：整码插入或整码缺失称~；当插入或缺失连续排列的核苷酸数目是3的整倍数时，其结果是仅导致密码子的插入或缺失突变，而不引起移码突变--DPP与DSP
    • 6.how to judge 单基因病的致病性突变？mutation position→mutation characteristics→distribution in population
• 口腔肿瘤分子生物学
  • definition：①细胞增殖cell proliferation：通过细胞分裂增加细胞数量 G1→S→G2→M 检查点-G/S,G/M,纺锤体装配检查点 G0期-休眠细胞和干细胞可以短暂退出细胞周期，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，这个时期的细胞称为~ ②细胞凋亡apoptosis❤：细胞程序性死亡CPD，是指细胞主动性的程序性死亡，表现为细胞染色体DNA片段化，形态学上主要是细胞核固缩、碎裂，细胞皱缩分解形成凋亡小体，最终被其他细胞吞噬而清除 necrosis：细胞因病理而产生的被动死亡，表现为膜通透性增高，最终细胞裂解释放出内含物，并常引起炎症反应 pyroptosis：细胞凋亡的一种特殊形式，是促炎程序性细胞死亡方式 ③细胞自噬autophagy：一系列自噬体结构演变的过程，由自噬相关基因autophagy-related-gene执行的精细调控过程。
  • molecular mechanisms of tumor occurance：癌基因erbB-2和抑癌基因P53
  • molecular mechanisms of tumor metastasis
    • 转移过程： 五步①癌细胞侵入局部组织基质 ②癌细胞进入脉管系统，包括血液循环或淋巴系统 ③癌细胞在远处脉管黏附和形成癌栓（少部分高转移潜能癌细胞迁移出血管壁） ④癌细胞移出脉管，并在继发组织器官定位生长，形成转移病灶 ⑤转移病灶继续扩散，形成新的转移病灶
    • 分子机制：①诱导新的血管形成-VEGF-A,C,D ②肿瘤细胞粘附能力的变化-钙黏蛋白E-cadherin ③细胞外基质的破坏和细胞运动-MMP-9 ④逃避免疫监视
• 基因：基因是一段DNA序列，其转录产物是一条多肽或蛋白的RNA或具独立功能的RNA，基因决定遗传性状。 基因组genome：细胞或者生物体的整套DNA，基因组包括整套基因的编码序列，同时还包括基因内的非编码序列及基因间序列。