导图社区 DNA重组和重组DNA技术
生物化学第九版内容，DNA重组和重组DNA技术是指不 同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段 的交换幵重新组合形成新DNA分子的过程。
第九版外科学麻醉，内容有 麻醉前准备和麻醉前用药、全身麻醉、局部麻醉、椎管内麻醉、麻醉期间和麻醉恢复期间的检测和管理，快来看看吧！
药理学第九版肾上腺皮质激素类药物的药理作用临床应用和不良反应等，整理了糖皮质激素、盐皮质激素、促皮质激素及皮质激素抑制药的内容，看过这个我相信你肯定会有收获的。
药理学第九版第36章甲状腺激素及抗甲状腺药的药理作用及其机制、临床应用、不良反应等
社区模板帮助中心，点此进入>>
英语词性
法理
刑法总则
【华政插班生】文学常识-先秦
【华政插班生】文学常识-秦汉
文学常识：魏晋南北朝
【华政插班生】文学常识-隋唐五代
民法分论
日语高考動詞の活用
第14章DNA的生物合成读书笔记
DNA重组和重组DNA技术
概念
DNA重组
DNA重组:是指DNA分子内/分子间发生的遗传信息的重新共价组合
分类
同源重组
位点特异重组
转座重组……
重组DNA技术
重组DNA技术:是指通过体外操作将不同来源的两个/两个以上的DNA分子重新组合， 并且在适当细胞中扩增形成新的功能分子的技术。
自然界的DNA重组和基因转移
同源重组是最基本的DNA重组方式
概念:是指发生在两个相似/相同的DNA分子之间 核苷酸序列互换的过程（基本重组）
哺乳动物:减数分裂，同源重组→DNA序列新重组，标志着后代的遗传变异 细菌和病毒→水平基因转移→通过同源重组→互换遗传物质
具有同源序列的两条DNA链通过断裂→再连接→DNA单链/双链片段的交换
同源重组缺陷与人类癌症高度相关
利用同源重组的原理→基因敲除/基因敲入
holliday模型是最经典的同源重组模式
同源重组不需要特异DNA，依赖两分子之间序列的相同/相似性
经历四个步骤
两个同源染色体DNA排列整齐
一个DNA一条链断裂，与另一个DNA对应链连接， 这个过程中形成了十字结构→holliday连接
通过分支移动→异源双链DNA（holliday中间体）
holliday中间体切开并修复→两个双链重组体DNA
切开的链与原来断裂的是同一条链→片段重组体 （重组体还有一段异源双链区，两侧来自同一亲本）
切开的链并非原来断裂的链→拼接重组体 （重组体异源双链区的两侧来自不同亲本）
RecBCD模型是大肠埃希菌的holliday同源重组
参与细菌RecBCD同源重组的酶
RecBCD复合物
有三种酶活性 ①依赖ATP的核酸外切酶活性 ②可被ATP增强的核酸内切酶活性 ③需要ATP的解旋酶活性
利用ATP提供的能量沿DNA运动，并将前方DNA解旋
遇到chi位点（5′-GCTGGTGG-3′）是，可在其下游切除3'端游离单链→使DNA重组成为可能
RecA蛋白
可结合DNA单链→RecA-ssDNA复合物
复合物作用
有同源DNA时，此复合物可与含同源序列的靶双链DNA相互作用 并将结合的单链DNA插入双链DNA的同源区，与互补链配对→将同源链置换出来
RuvC蛋白
有核酸内切酶活性，
专一识别holliday连接点 有选择的切开同源重组体的中间体
过程:
位点特异重组是发生在特异位点间的DNA整合
综述
位点特异重组:是指发生在至少拥有一定程度序列同源性片段间的DNA链的互换过程 （也称:保守的位点特异性重组）
酶:位点特异重组酶（SSR）通过识别和结合DNA短序列（位点使DNA片段发生重排）
①λ噬菌体DNA可与宿主染色体DNA发生整合
λ噬菌体整合:是λ噬菌体的整合酶催化完成的 是λ噬菌体DNA和宿主染色体DNA特异靶位点之间的选择性整合
由整合酶催化的DNA整合是十分特异且有效
逆转录病毒整合酶可以特异的识别、整合逆转录病毒cDNA的长末端重复序列
②基因片段倒位是细菌位点特异性重组的一种方式
以鼠伤寒沙门菌H抗原编码基因的H片段为例
p424
③免疫球蛋白基因以特异性重组发生重排
转座重组可使基因位移
概念:转座重排是由插入序列和转座子介导的基因移位/重排
插入序列是最简单的转座元件
插入序列:（IS）是指能在基因（组）内部/基因（组）间改变自身位置的一段DNA序列
转座子的一种，只携带与自身转座有关的编码基因
具有独特的结构特征:两端是反向重复序列 中间是转座酶编码基因 转座酶基因编码的产物可以使IS转座
IS转座有
保守性转座
IS从原位→新位
复制性转座
IS复制后的一个复制本移至新位
转座子可以在染色体间转座
转座子（Tn）:是指能将自身/将其拷贝插入基因组新位置的DNA序列
一般属于复合型→有一个中心区域，两边侧翼都是IS 还携带其他基因（抗生素抗性基因…）
Tn普遍存在于真核和原核细胞中，不但可以在一条染色体上动 可以从一条→另一条 一个细胞→另一个
原核细胞可以通过接合、转化、转导进行基因转移/重组
细胞间直接作用（接合）细胞主动摄取（转化）噬菌体传递（转导）
接合作用是质粒DNA通过细胞间相互接触发生转移的现象
转化作用是受体细胞自主摄取外源DNA并与之整合的现象
转导作用是病毒将供体DNA带入受体并与之染色体发生整合的现象
普遍性转导
特异性转导（限制性）
重组DNA技术：又称分子克隆、DNA克隆/基因工程
指：通过体外操作将不同来源的两个或两个以上DNA分子重新组合，并在适当细胞中扩增形成新功能DNA分子的方法
过程：
在体外将目的DNA片段与能自主复制的遗传原件连接→重组DNA分子
进而在受体细胞中复制、扩增及克隆化→获得单一DNA分子的大量拷贝
重组DNA技术中的常用酶
常用工具酶的各自功能
限制性核酸内切酶是最重要的工具酶
总括
能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键
少数来自绿藻 绝大数来自细菌
和一起存在的甲基化酶共同构成限制-修饰体系
RE对甲基化的自身DNA不起作用仅对外源DNA切割
RE的分类及其特点
根据RE组成、所需因子及其裂解DNA方式
I型和ⅲ型
复合功能酶，同时有限制和DNA修饰作用
不在所识别的位点切割DNA（特异性不强）
II型
能在DNA双链内部的特异位点识别and切割→分子✂️，准确切割
RE的命名原则
RE识别及切割特异DNA序列
II型RE识别位点通常为6/4个碱基序列 个别 8/8个以上
大多数识别为回文序列
回文序列
两条核苷酸链的特定位点，从5'→3'的方向方向序列完全一致
RE中的同尾酶
虽识别序列不同，但是切割DNA产生相同的单链末端
产生相同的黏端→配伍末端
配伍末端可以共价连接 但是连接后的序列通常不能再被两个同尾酶中任何一个识别切割
RE中的同裂酶
来源不同但可以识别同一序列（位点相同/不同）
重组DNA技术中常用载体
载体:
载体:是为携带目的外源DNA片段→实现DNA在受体cell中的无性繁殖/表达蛋白质所采用的DNA分子
功能分为
克隆载体
表达载体
克隆载体用于扩增克隆化DNA分子
概
克隆载体指:用于外源DNA片段的克隆和受体细胞中扩增的DNA分子
具备特点
至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中自主复制 并且能使得克隆的外源DNA片段得到同步扩增
至少有一个选择标志，从而区分含有和不含有载体的细胞
有适宜的RE单一切位点，可供外源基因插入载体
质粒克隆载体
质粒:是细菌染色体外的，可以自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子
噬菌体DNA载体
λ和M13噬菌体作为噬菌体克隆载体
λ噬菌体DNA
λgt系列
插入型载体，适用于cDNA克隆
EMBL系列
置换型载体，适用于基因组DNA克隆
M13噬菌体
M13mp系列
pUC系列
蓝白筛选
有外源基因插入lacZ→干扰lacZ表达→白色
没有外源基因→lacZ正常表达→蓝色菌落
α互补
其他克隆载体
携带较长外源基因的能力
设计
柯斯质粒
细菌人工染色体载体（BAC）
酵母人工染色体载体（YAC）
表达载体能为外源基因提供表达原件
指:用来在宿主细胞中表达外源基因的载体
宿主细胞不同
原核表达载体
真核表达载体
主要区别:为外源基因提供的表达原件
除了克隆载体的特点
还有→提供外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列 eg.启动子、核糖体结合位点（S-D序列）
特点
含有必不可少的原核系列（用于真核表达载体在细菌中复制及阳性克隆的筛选）
真核表达调控原件
真核复制起始序列
真核细胞药物抗性基因（用于阳性筛选）
重组DNA技术的基本原理及操作步骤
步骤
目的DNA的分离获取
载体的选择与准备
目的DNA与载体的连接
重组DNA转入受体细胞
重组体的筛选和鉴定
分选连转筛
具体过程
目的基因的分离获取是DNA克隆的第一步（方法）
化学合成法
直接合成目的基因
前提:已知目的基因的核苷酸序列/根据AA序列→相应核苷酸序列
从基因组文库和cDNA文库中获取目的DNA
PCr方法
高效特异扩增体外DNA
前提:已知带扩增目的基因/DNA片段两端的序列，并且根据该序列→合成引物
其他方法
载体的选择与准备是根据目的DNA片段决定的
目的
目的DNA与载体连接形成重组DNA
根据目的DNA和线性化载体末端的特点
连接策略分为
黏端连接
单一相同黏端连接
目的DNA序列两端和载体两端为同一RE切割→黏端完全相同
连接可能性
载体自连
目的基因自连
载体和目的基因相连
缺点:给后续筛选带来困难
采用碱性磷酸酶处理载体DNA→去磷酸化→减少载体自身环化
目的基因反向插入载体→不影响克隆→影响表达
不同黏端连接
黏性末端不同→外源DNA定向插入载体（定向克隆）
可有效避免DNA自连/DNA片段反向插入载体……
通过其他措施产生黏端的连接
平端末端产生黏端
方法
人工接头
……
特点:连接效率高、方向性！准确性！
平端连接
同 同黏端连接 且效率低
黏-平端连接
定向克隆 效率 介于黏端和平端连接之间
重组DNA转入宿主cell使其得以扩增
总括理想宿主细胞→工程细胞
工程细胞
DNA/蛋白质降解系统和重组酶缺陷
有较强的接纳外源DNA的能力
可以保证外源DNA长期、稳定地遗传/表达
将DNA导入宿主细胞方式:
转化
将外源DNA直接导入细菌、真菌的过程
只有细胞膜通透的细菌→感受态细胞
将质粒DNA→酵母cell和将黏粒DNA→细菌的过程也是！
转染
将外源DNA直接导入真核细胞（除酵母）
噬菌体DNA→受体细菌也是……
感染
以病毒颗粒作为外源DNA运载体→宿主细胞内
重组体的筛选与鉴定
重组DNA分子→宿主细胞后 通过载体携带的选择标记/目的DNA片段的特有序列→筛选鉴定→获得含有目的DNA的宿主细胞
遗传标志筛选法
序列特异筛选法
亲和筛选法
借助载体的遗传标志进行筛选
载体上通常含有可供重组体筛选的遗传标志
利用抗生素抗性筛选
抗性基因的重组载体→能生长→有导入载体
利用基因的插入失活/插入表达特性筛选
当目的基因插入抗性基因→抗性基因失活→含有重组DNA不能生活
利用标志补救筛选
载体上的标志基因在宿主细胞表达→宿主与标志基因产物互补弥补自身缺陷→在培养基存活
也可以用于外源基因导入哺乳类动物后的阳性初筛
α互补筛选法也是
利用噬菌体的包装特性筛选
λDNA的大小有要求 没有外源基因的单一噬菌体 太小不能→活噬菌体颗粒→不能形成菌斑
序列特异性筛选
RE酶切法
针对初筛为阳性的克隆
提取重组DNA，酶切→琼脂糖凝胶电泳→有无目的DNA片段插入+大小 还可以鉴定方向
PCR法
引物特异性→PCr扩增→鉴定含有目的基因的阳性克隆
核酸杂交法
直接筛选和鉴定有目的DNA的克隆
菌落/噬菌斑原位杂交法
DNA测序法
最准确的鉴定目的DNA的方法
已知序列→明确具体序列和可读框的准确性
未知序列→揭示其序列
前提:重组DNA进入宿主细胞后能表达出其编码产物
克隆基因的表达
原核表达体系
常用大肠杆菌
必备条件
含有大肠杆菌适宜的选择标志
有强启动子
适当的翻译调控序列
合理设计的多克隆酶切位点
缺点
缺乏转录后加工→对于真核基因→大肠杆菌只能逆转录合成cDNA编码产物 不易表达从基因组DNA扩增的基因
缺乏翻译后加工体系→蛋白质不能正确折叠/糖基化修饰
蛋白质往往形成→不溶包含体
很难表达可溶性蛋白质
真核表达体系
优点 与大肠杆菌相反就是优点
