第二章 真菌检验基本技术

微生物检验技术 真菌检验 微生物检验技术，真菌检验基本上可分为培养技术和非培养技术两大类，欢迎参考本图学习。

真菌检验基本技术

• 形态学检查
  • 注意
    • 检查方面 ：致病性、传染性、传播途径、环境污染
    • 1、真菌孢子可空气传播，操作应在生物安全柜进行
    • 2、每天工作签应对工作区域进行消毒
    • 3、不可直接闻培养基气味，以免孢子散播感染
    • 4、不可对组织胞浆菌、球孢子菌玻片培养，因空气传播
  • 一、标本采集注意事项
    • 1、标本来源要适宜
      • 浅部真菌--采集毛发 皮屑 指屑
      • 深部真菌-痰液 血液 脑脊液
    • 2、要在用药前采集标本
    • 3、采集标本要充足
    • 4、采集过程中要严格无菌操作
    • 5、采集后立即送检
  • 二、直接镜检
    • 标本制备
    • 常用标本处理液
      • KOH
        • 适用致密、不透明标本
        • 促进角质蛋白溶解
      • 生理盐水
        • 观察真菌出芽现象
      • 水合氯醛-苯酚-乳酸封固液
        • 不透明标本检查
    • 显微镜观察
      • 低倍镜观察有无菌丝或孢子
      • 高倍镜观察形态特征（保证暗视野
  • 三、染色镜检
    • 1、革兰染色
      • 各种真菌均为阳性-深紫色
    • 2、乳酸酚棉蓝染色
      • 蓝色 适用：直接真菌直接镜检、培养涂片、小培养标本保存
    • 3、墨汁复染
      • 用于有荚膜的真菌、背景黑色，菌体不着色
    • 4、荧光染色
      • 通常有直接涂片、培养涂片、组织切片染色三种方法
      • 0.1%吖啶橙+20%KOH
      • 荧光反应
        • 白假丝酵母-黄绿
        • 新生隐球菌-红色
        • 曲菌-绿色
    • 5、瑞氏染色
      • 染后油镜观察、常用于组织或骨髓中组织包浆菌等真菌检查
    • 6、糖原染色
      • 又称过碘酸染色PAS\PASH，用于直接涂片和组织病理切片染色检查
      • 背景淡绿色，菌体红色
    • 7、六胺银染色
      • 卡氏肺孢子虫-黑色或黑褐色
  • 四、形态学检查意义
    • 优点
      • 1、有诊断意义：可以判断有些真菌种致病性
      • 2、代表组织相：镜检看到真菌的形态就是该真菌的组织形态
    • 局限性
      • 1、灵敏度低：直接镜检不如培养敏感，可能会使假阴性
      • 2、假阳性：溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁复染会被误认成新生隐球菌
• 非培养鉴定
  • 免疫学检验
    • 1、真菌感染的诊断，主要取决于病原学诊断
    • 2、真菌产生抗体的速度慢、滴度低易引起严重反应
    • 3、皮试实验
      • 提取真菌抗原、进行皮内注射或斑贴实验，观察注射或实验部位有无红肿硬结
    • 4、血清学
      • 用乳胶凝集、酶联免疫、补体结合、荧光抗体及放射实验测定血清该抗体水平
  • 分子生物学
    • 1、DNA探针杂交、PCR及脉冲场凝胶电泳分析（PFGE）
    • 2、常用检测片段：18SrRNA、P450、5SrRNA、gp43、26SITS
    • 3、G实验
      • 检测真菌细胞壁成分（1，3）-β-D-葡聚糖
      • 可鉴定侵袭性真菌 不可鉴定隐球菌、接合菌感染
    • 4、GM实验
      • 检测GM（半乳甘露聚糖），是由细胞壁表面释放的最早Ag
      • 该实验是国际公认能作为侵袭性曲霉菌感染的早期依据诊断方法
• 培养鉴定
  • 一、分离培养
    • 工具
      • 平皿、试管、培养箱、接种针、接种环和接种钩
    • 培养基
      • 营养要求不高，最适PH4~6。
      • 不同培养基真菌菌落变化很大，一般用沙保罗培养基上的生长现象来描述菌落形态
    • 标本预处理
      • 加入氯霉素 青霉素可防止细菌生长
      • 培养皮肤癣菌时加入 放线菌酮抑制污染性真菌
  • 二、培养方法
    • 试管培养法
      • 最常用、用于菌种传代接种。
      • 使用方便、不易污染；但展示面积不够，不能完全显示菌落形态
    • 大培养法
      • 用培养皿或大型培养瓶装入培养基，接种标本
      • 菌落大，易于观察；但接种易受污染
    • 小培养法
      • 微量培养法，是观察真菌结构及生长发育的有效方法
      • 包括玻片培养、小型盖片培养、琼脂方块培养法等
  • 三、生长现象（菌落）
    • 1、生长速度
      • 与菌落培养有关
      • 快速生长（7-10d出现菌落）、慢速生长（3周内出现少许菌落）
    • 2、菌落大小
      • 与菌种、生长速度、培养环节、培养时间长短有关
    • 3、菌落性质
      • 酵母型、类酵母型、丝状菌落
      • 丝状菌落可呈现棉絮状、绒毛状、或粉末状等形态）
    • 4、菌落颜色
      • 不同菌种有不同颜色、丝状菌落的表面和底层颜色不同
    • 5、菌落边缘
      • 有的整齐如刀、有的呈羽毛状
    • 6、菌落底部
      • 有的会陷入培养基、有甚至会使培养基开裂
  • 四、抗真菌药物分类（作用部位）
    • 1、细胞壁
      • 普拉米星
    • 2、细胞膜
      • 两性霉素B、酮康唑
    • 3、核酸（干扰DNA合成）
      • 5-氟胞嘧啶
    • 其他
      • 大蒜新素 冰醋酸
  • 鉴定试验
    • 毛发穿孔试验
      • +石膏样小孢子菌
      • -- 红色毛癣菌
    • 明胶液化试验
    • 芽管形成试验
      • 牙管形成试验白假丝酵母菌在动物血清中孢子伸长不断裂,能形成芽管,但并非所有的假丝酵母菌都能形成芽管,借此鉴定酵母样真菌。试验要设阳性(白假丝酵母菌)和阴性对照(热带假丝酵母菌),并注意控制培养时间。
    • 厚膜孢子形成试验
      • 厚膜孢子形成试验玉米琼脂加Tween-80可以降低培养基表面张力,很适宜酵母样真菌的菌丝和芽生孢子的生长,白假丝酵母菌在此培养基上能产生厚膜孢子,借此可鉴定白假丝酵母菌。
    • 脲酶试验
    • 糖同化或发酵试验
      • 检测真菌对糖类中碳源利用能力的一种极有价值的试验。其原理是某些真菌在不含碳源而仅含氮源的合成固体培养基上不生长,当培养基中加入该菌能利用的碳水化合物时,则该菌生长。一般对双糖类发酵的真菌,都能同化或利用糖类或碳源,主要用于鉴定酵母菌。
  • 五、药敏试验目的
    • 1
      • 提供两种以上有相当活性的抗真菌药物的可信测量方法
    • 2
      • 检测体内活性、可预测治疗的效果
    • 3
      • 监测耐药性的发生
    • 4
      • 可预期研究新药的潜在治疗效能
  • 六、抗真菌药物敏感试验
    • 稀释法（定量）
      • MIC（可以观察到能抑制真菌生长的最低药物浓度，即最小抑菌浓度
      • 主要采用肉汤稀释法、包括常、微量稀释法
    • 实验步骤
      • 1、试验前准备
        • 培养基制备、药物原液配制、接种菌液制备、药物稀释
      • 2、常用方法
        • 常量稀释法、微量稀释法
      • 3、结果观察
        • 观察各管（孔）生长情况
      • 4、质量控制
        • 采用标准菌株作为每次测定质控菌株，其MIC应落在预期值范围里
    • 扩散法（定性）
      • 具体操作同“细菌药敏试验纸片扩散法”相似