动物细胞培养技术

细胞工程之动物细胞培养技术思维导图，介绍了动物细胞的培养方法、动物细胞的培养基、生产用动物细胞、动物细胞培养条件等。

动物细胞培养技术

• 体外培养动物细胞的类型
  • 贴壁依赖性细胞： 细胞在支持物表面生长
    • 常用的贴壁因子： 多聚赖氨酸，明胶
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    • 1， 选择合适的培养器具（是否需要进行预处理） 2， 特殊细胞需要特殊的预处理。（如干细胞等）
  • 非贴壁依赖性细胞：悬浮细胞，不需要固体支持物
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  • 兼性贴壁细胞： 可以贴壁也可以悬浮生长
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• 动物细胞培养条件
  • 温度： 哺乳动物细胞： 37 ℃； 昆虫细胞： 25-28 ℃； 鱼类细胞： 24-26 ℃
  • pH及缓冲体系： pH=7.2-7.4。一般使用酚红作为指示剂 常用的细胞培养缓冲体系有：NaHCO3, HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸）等
  • 通氧量： 一般使用正常空气的氧浓度 5%的CO2是为了在NaHCO3作为缓冲体系时维持合适的PH。 HEPES缓冲体系不需要5% CO2
  • 抗生素： 一般使用青霉素，链霉素（双抗）抑制细菌生长
• 动物细胞培养特性
  • 接触抑制
    • 接触抑制是将多细胞生物的细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动和生长的现象。
    • 接触抑制会导致细胞的状态急剧恶化，即使是癌细胞，过高的培养密度也会显著影响细胞状态。
  • 评估细胞状态的好坏方法
    • 形态观察
    • 活性检测
      • 台盼兰染色
      • 荧光染料染色（PI，DAPI等）
      • MTT比色法
      • Caspase3染色等检测细胞凋亡等
• 生产用动物细胞
  • 几个常用的细胞库
    • 中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心 ) CCTCC  中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 http://www.cellbank.org.cn/ 昆明细胞库 http://kz.brim.ac.cn/CELL.HTM 协和医科大学基础医学细胞中 http://www.cams.ac.cn/pumc/jiaoxue_hj/zhongdian_sys.htm ATCC （ American type culture collection） http://www.atcc.org/pdf/tcl.pdf
  • 细胞STR鉴定
• 动物细胞的培养基
  • 基础培养基（合成培养基）
    • 经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO) 、Thermo Fisher(HyClone) 、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI1640、MEM 、DMEM/F12 都是应用最广泛的培养基。其他 如M199、IMDM 、L15培养基等也用于某些细胞的培养。
  • 血清培养基
    • 常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为胎牛血清和新生牛血清，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。
  • 无血清培养基
    • 不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。
• 动物细胞的培养方法
  • 原代培养
    • 单层细胞培养法
    • 组织块培养法
  • 细胞传代（passage)
    • 扩大细胞培养的数量，同时也避免了因细胞进入平台期乃至衰亡期而大量死亡
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  • 细胞计数
    • 扩大细胞培养的数量，同时也避免了因细胞进入平台期乃至衰亡期而大量死亡
  • 细胞克隆培养
    • 单细胞培养，使之增殖获得纯系细胞株
  • 细胞冻存和复苏
    • 基本原则：“慢冻速融”