SCI文献解读系列1-卵巢癌-IF15

这是一篇关于SCI文献解读系列1-卵巢癌-IF15的思维导图，主要内容有卵巢癌患者中FBN1表达水平与顺铂耐药相关临床相关性)、FBN1敲除可以促进糖酵解和血管新生、敲除FBN1可以抑制卵巢癌细胞的糖酵解和血管生成，且抑制糖酵解可以增加卵巢癌细胞的顺铂敏感度等。

数据分析

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  • 卵巢癌患者中FBN1表达水平 与顺铂耐药相关（临床相关性）
    • • 作者分别从顺铂耐药/顺铂敏感的卵巢癌患者中分离出 10 对类器官，再分别用或不用顺铂（5ug/L） 处理 21 天，镜下观察（1A）， 并通过 CCK8检测 4 对耐药/敏感、处理/非处理组类器官的细胞活力， 结果发现顺铂耐药的类器官，无论加药处理与否，细胞活力都持续增加， 而顺铂敏感组的类器官，顺铂加药处理后细胞活力明显下降（1B）。随后作者通过高通量测序方法，检测了6对顺铂耐药/顺铂敏感的类器官表达谱，共识别出 2808 个差异表达基因，其中 1532 个上调， 1276 个下调。 GSEA 分析结果显示， FBN 家族在顺铂耐药组中显著富集（1C），且根据 GEO 数据库和上海交通大学新华医院收录的信息， FBN1 的高表达和卵巢癌患者预后密切相关（Supplementary S1C-F）。随后作者通过免疫荧光和 RT-PCR 检测了 10 对类器官中 FBN1 的表达，结果显示，在顺铂耐药类器官中， FBN1 显著高表达（1D、 E），卵巢癌患者组织免疫组化切片结果也显示，较顺铂敏感的患者，顺铂耐药患者组织中 FBN1 高表达（ 1F）；顺铂耐药患者中FBN1 高表达的比例明显增加（1G） 。 此外，顺铂耐药患者的组织化学评分 H-score、mRNA 水平和免疫荧光强度，都显著高于顺铂敏感患者（1H-J）。
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  • FBN1敲除可以促进糖酵解和血管新生
    • • 为进一步研究 FBN1 对卵巢癌顺铂耐药的影响，作者分别在顺铂耐药类器官和细胞系中敲除FBN1，并通过 WB 检测敲除效果（2A）。 CCK8 和细胞克隆实验发现， FBN1 敲除可以明显增加卵巢癌类器官、细胞系的顺铂敏感性（Supplementary 2C-H）。作者用 RNA 测序分析了敲除 FBN1 的类器官的基因表达情况，并通过 GSEA 和质谱分析发现， FBN1 关键调控分子在糖酵解和血管生成上显著富集（2B-D），且敲除 FBN1后，糖酵解相关代谢物明显减少（2E）。 作者还对比了 FBN1 敲除对一些糖酵解和血管生成关键分子表达的影响，通过热图可以看出，敲除 FBN1 后，这些分子的表达明显下降（2F）。
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  • 敲除 FBN1 可以抑制卵巢癌细胞的糖酵解和血管生成， 且抑制糖酵解可以增加卵巢癌细胞的顺铂敏感度。
    • • 作者检测了卵巢癌顺铂耐药类器官和细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、 ATP 生成、 NADPH 生成水平、 ECAR、 OCR，结果发现敲除 FBN1 后，以上指标均下降（Figure 3A-C），提示糖酵解过程被抑制。此外，作者用卵巢癌细胞的培养上清处理 HUVECs，结果发现敲除 FBN1 的卵巢癌细胞上清处理的HUVECs 血管形成数量明显减少（Figure 3D）。随后，作者用阿帕替尼处理卵巢癌顺铂耐药类器官和细胞，结果发现敲除 FBN1 的同时用阿帕替尼处理，比只敲除 FBN1 和只用阿帕替尼处理，更能明显增加类器官和细胞对顺铂的敏感性，顺铂处理后细胞活性、增殖能力明显下降（Figure3E-G）。 作者又用 2-DG（糖酵解抑制剂）处理卵巢癌顺铂耐药类器官和细胞系，结果发现2-DG 处理后也能进一步增强敲除 FBN1 所致的卵巢癌类器官和细胞对顺铂敏感型的增加（Figure 3H-J）。
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  • FBN1 与 VEGFR2 结合，促进 VEGFR2 的 1054 位酪氨酸磷酸化 ，进而激活 FAK/AKT1通路。
    • • 为进一步明确 FBN1 调控卵巢癌细胞糖酵解的分子机制，作者在 FBN1 高表达的卵巢癌顺铂耐药类器官中进行了 IP+质谱分析，确定卵巢癌顺铂耐药过程中可以和 FBN1 互作的蛋白，其中包括血管生成密切相关的 VEGFR2。于是作者又通过 co-IP 和荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像（FRET-FLIM） 方法，进一步确定 FBN1 和 VEGFR2 的互作关系（Figure 4A-C） 。 质谱分析识别出 VEGFR2 的 1054 酪氨酸残基是主要磷酸化位点， WB 结果显示，敲除 FBN1后， 被检测的四个 VEGFR2 酪氨酸位点中 1054 位磷酸化水平下降，同时 FAK 的 397 酪氨酸残基、 AKT1 的 473 丝氨酸残基的磷酸化水平也明显下降（Figure 4D），免疫荧光结果也显示 VEGFR2 的 1054 位酪氨酸磷酸化减少。 然而，敲除 FBN1 的同时过表达 VGEFR2，可以回复由 FBN1 敲除引起的 AKT1 磷酸化水平下降（Figure 4F），提示 FBN1 通过 VEGFR2 调控AKT1 的磷酸化修饰。 作者进一步分析了 VEGFR2 和 FBN1 的结合域，结果显示 FBN1 主要结合在 VEGFR2 的 D2、 D3 区域（Figure 4G）。于是，作者又构建了 VEGFR2 的 D2、 D3 区域突变体（Figure 4H）， WB 结果显示 VEGFR2 的 D2、 D3 区域突变后， AKT1 的磷酸化水平明显下降（Figure 4I），提示 AKT1 的激活与 VEGFR2 的 D2、 D3 区域密切相关。
        • 补充： FRET-FLIM 是荧光寿命成像（FLIM）和 Forster 共振能量转移（FRET）相结合的一种 技术方法，当生物供体荧光分子与受体相互作用时，会产生荧光能量共振转移（FRET）， FRET 信号强烈依赖于 FRET 配体和受体的距离，一般要小于 10nm，分子越近， FRET 发生的概率 越高。可以简单理解为，被检测的分子间发生互作时，荧光信号的时间会缩短，这一现象可 以通过 FLIM 检测记录。因此 Figure 4B、 C 中， FBN1 和 VEGFR2 发生互作，荧光信号时间 减少。
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  • FBN1 通过 VEGFR2 调控 STAT2 蛋白水平 和磷酸化水平，并影响糖酵解和血管新生。
    • • 作者对比了敲除 FBN1 后卵巢癌顺铂耐药类器官和对照组的差异表达基因，并通过 GSEA 分析发现， FBN1 敲除和 STAT 家族基因表达密切相关（Figure 5A），进一步检测 STAT 家族分子的 mRNA 水平发现，敲除 FBN1 后， STAT 家族基因的 mRNA 水平明显下降（Figure 5B）。敲除 FBN1 后，细胞核内的 STAT2 蛋白水平下降，磷酸化水平也明显下降，然而胞浆中这一变化并不明显（Figure 5C），免疫荧光结果也提示敲除 FBN1 后， p-STAT2 明显减少（Figure5D）。回复实验发现，敲除 FBN1 的同时过表达 VEGFR2，可以回复敲除 FBN1 导致的 STAT2蛋白水平下降和磷酸化水平下降，同时敲减 STAT2 则会再次回复过表达 VEGFR2 引起的回复（Figure 5E），提示 FBN1 通过 VEGFR2 调控 STAT2 的表达水平和活性。 糖酵解相关分子检测结果与前文一致，敲除 FBN1 的同时过表达 VEGFR2 可以回复敲除所致的糖酵解相关分子表达抑制，再同时敲减 STAT2 则会使相关分子表达再次被抑制（Figure 5F），血管生成也持相同的趋势（Figure 5G）。
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  • 动物实验，验证 FBN1 对血管生成、糖酵解的调控
    • • 动物水平验证，敲除 FBN1 可以增加耐药卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，同时使用阿帕替尼可以进一步增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性（Figure 6A-C）。 PET-CT 扫描结果显示，敲除 FBN1可以明显抑制裸鼠体内的葡萄糖摄取，同时用阿帕替尼可以进一步增强这一效果（Figure 6D、E）。 作者通过注射 FBN1 反义吗啉环寡核苷酸实现斑马鱼体内的 FBN1 敲减，并用 qRT-PCR验证 FBN1 的 mRNA 水平（Figure 6F）。斑马鱼体内血管形成实验结果显示，敲减 FBN1 明显抑制血管生成（Figure 6G），血管内皮生长因子 VEGFA 的 mRNA 水平明显下降， 同时使用阿帕替尼处理可以增强对顺铂的敏感性（Figure 6H）。此外，作者再次在体内验证了敲除FBN1 对血管生成、糖酵解相关分子、 STAT2 相关分子表达的影响（Figure 6I-K）。
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  • 临床样本验证， FBN1 高表达促进卵巢癌细胞的糖酵解， 同时促进 VEGFR2 和 STAT2的磷酸化。
    • • 作者通过免疫组化分析了卵巢癌组织中 FBN1、p-VEGFR2、p-STAT2 的表达水平（Figure 7A），同时检测了患者血清中 VEGFA 的水平，结果发现 FBN1 低表达的患者血清中 VEGFA 的水平明显低于 FBN1 高表达的患者（Figure 7B）。 PET-CT 扫描分析卵巢癌患者体内葡萄糖摄取的情况， 结果显示 FBN1 低表达的患者 SUVmax 值明显低于 FBN1 高表达的患者（Figure 7C、D），且 SUVmax 值和卵巢癌患者的预后呈负相关，即高 SUVmax 值和不良预后相关（Figure7E）。 作者还检测了卵巢癌患者组织中糖酵解相关分子的表达情况（Figure 7F），以及免疫荧光观察 FBN1、 p-VEGFR2、 p-STAT2 的水平差异（Figure 7G），结果均与细胞实验和动物实验的结果一致。最后，作者通过一个机制示意图概括了本文的主要分子机制： FBN1 通过与VEGFR2 结合促进其磷酸化，从而激活 AKT/FAK 通路，进而促进 STAT2 的磷酸化，促进糖酵解和血管生成，导致顺铂耐药。

文章框架分析

• 五要素
  • 疾病： 卵巢癌；
  • 表型： 糖酵解、血管新生、耐药；
  • 细胞模型： 顺铂耐药卵巢癌细胞OVCA433， 顺铂耐药类器官，人脐静脉内皮细胞 HUVECs
  • 动物模型： 斑马鱼、裸鼠皮下成瘤；
  • 实验方法： cck8、细胞克隆、 co-IP、 WB、qRT-PCR、ELISA、免疫组化、免疫荧光、体外成管实验等
  • 分子机制： FBN1靶向结合 VEGFR2，促进 VEGFR2 磷酸化，激活 AKT/FAK 通路，促进STAT2 磷酸化，从而促进卵巢癌细胞的糖酵解和血管新生以及顺铂耐药。
    • 原纤维蛋白-1 (FBN1) 属于原纤维蛋白家族，是一种大的细胞外基质糖蛋白，可形成线 状微纤维丝，为组织提供结构支撑，在皮肤和血管中形成弹性纤维，调节转化生长因子 β (TGF-β) 的功能及微环境。 已经证实， FBN1 的基因突变会导致常染色体显性遗传病马 凡综合征以及其他相关的结缔组织疾病，统称为 1 型原纤维病。 且有研究表明， FBN1 在睾丸生殖细胞肿瘤中过表达，并有助于原位肿瘤的发展；此外， FBN1 启动子的甲基 化修饰是结直肠癌的独特分子标志物。
• 文章思路梳理
  • 1.主变量单变量论证： Fig1-3 2.二元交互论证（主变量-交互变量） ： Fig 4A-C、 G（结合位点） 3.主变量调控交互变量： Fig 4D、 E 4.主变量调控效应变量： Fig 4D、 Fig 5A-D 5.回复实验： Fig 4F（调控必要性）、 Fig 4I（结构必要性） 、 Fig 5E-G 6.体内实验： Fig6 7.临床相关性： Fig 7A-G
• 亮点与不足
  • 亮点和不足： 1.本文数据维度非常广泛，不仅有数据库和临床信息的验证，也有自己的测序数据和生信分析结果，体内体外实验论证也比较充分，类器官的研究数据也贯穿全文，和细胞实验数据相互佐证； 2.本文的实验论证也很详实，多个实验中都同时设置多组对照，使用不同的抑制剂验证糖酵解对顺铂耐药的影响；验证交互时采用了 FRET-FLIM 检测方法，体内实验除常见的裸鼠皮下成瘤实验验证主变量对增殖的影响外，还通过斑马鱼验证了主变量对血管生成的影响，以及 PET-CT 检测动物及患者体内葡萄糖摄取的情况；实验中磷酸化修饰的验证也都具体到了位点； 3.验证完主变量 FBN1 和交互变量 VEGFR2 的结合之后，只分析了 VEGFR2 的结合位点，而没有探讨 FBN1 的结合位点，且没有论证 FBN1 和 VEGFR2 结合对 VEGFR2 磷酸化修饰的必要性，以及二者交互对下游通路激活、效应变量磷酸化的必要性，对表型的调控的必要性，都没有论证到位，全文论证涉及的变量较多，细节没有论证清楚，不够全面。
• The Fibrillin-1/VEGFR2/STAT2 signaling axis promotes chemoresistance via modulating glycolysis and angiogenesis in ovarian cancer organoids and cells cancer communication IF=15.283，2022 ，cancer communication