【生化】01生化概述-生化技术

重组DNA技术，分子生物技术知识点总结。框架清晰，内容丰富。帮助小伙伴快速掌握生化概述，生化技术的内容要点！

生化技术

• 重组DNA技术
  • ◎基因工程的考点内容还是需要大家重视的，重点在于关键酶和克隆载体。基本过程不需要详细掌握，只要了解大致方法即可（但考学硕的同学最好还是要理解其原理）。基因治疗属于基因工程在临床疾病方面的应用，需要注意其方法。
  • 工具酶
    • ①限制性核酸内切酶(Ⅱ型酶)
      • 限制性核酸内切酶 •来自于细菌。细菌同时含有甲基化酶和限制性核酸内切酶，对自身基因DNA位点进行甲基化修饰（实质是一种保护性修饰），对外来DNA利用内切酶进行切割。 •能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并进行切割。 •分为三型：I 型和Ⅲ型的切割位点与识别位点不一致，只有Ⅱ型酶能特异地识别双链DNA的特征序列，并严格地在此序列内的固定位点进行切割，是基因工程最常用的工具酶。 •Ⅰ型酶所识别的DNA位点呈典型的回文序列。 •切割结果：黏性末端和平末端。
      • 细菌的限制-修饰体系：甲基化酶、限制性核酸内切酶
      • Ⅱ型酶：基因工程常用、识别回文序列
      • Ⅰ型酶所识别的DNA位点呈典型的回文序列
      • 只有Ⅱ型酶能特异地识别双链DNA的特征序列，基因工程最常用的工具酶
      • 切割结果：黏性末端和平末端
    • ②DNA连接酶
      • 借助ATP水解提供的能量催化DNA分子中相邻的5'-磷酸基与3-'羟基末端之间生成磷酸二酯键，使DNA切口闭合或两个DNA分子片段连接。但DNA连接酶只能连接互补基础上双链中的单链缺口。
    • ③逆转录酶
      • 当以mRNA为初始实验材料时，首先需要利用逆转录酶合成cDNA.再进行基因工程的操作。
      • 工具酶
        • 限制性核酸内切酶：识别特异序列，切制双链DNA
        • DNA连接酶：催化双链DNA的单链缺口形成3'，5'-磷酸二酯键
        • 逆转录酶以：mRNA为模板合成DNA
        • Klenow片段：用于cDNA第二链合成，双链DNA3'-末端标记
        • 碱性磷酸酶：切除末端磷酸基团
        • 末端转移酶：在3'-羟基末端进行多聚物加尾
  • 载体
    • 克隆载体
      • 质粒
        • 质粒▲ 1.存在于细菌内、独立于染色体的小分子双链环状DNA 2.具有独立的自主复制能力。 3.携带有某些可遗传的标记（多是抗生素抗性基因），便于筛选、鉴定。 4.具有多克隆位点。
        • 细菌小分子环状双链DNA；自主复制； 携带抗生素抗性基因;具有多克隆位点
      • 常用克隆载体：质粒、噬菌体DNA、黏粒、酵母入工染色体、细菌入工染色体
      • 条件： 自主复制；遗传标记； 多克隆位点
        • 作为克隆载体的必备条件 1.具有自主复制的能力。 2.具有可遗传的标记或筛选标志。 3.具有多个限制性核酸内切酶的单一酶切位点（即多克隆位点），以供外源DNA的插入。 4.有足够的容量以容纳外源DNA。 常用的基因工程克隆载体有质粒、噬菌体DNA、黏粒、酵母入工染色体、细菌入工染色体。
    • 表达载体
      • 原核表达载体
        • 原核表达载体： 除了克隆载体的特点外，还应有启动子、SD序列等原核转录和翻译的序列。常用的是大肠杆菌表达载体。
        • 大肠杆菌表达载体
      • 真核表达载体
        • 真核表达载体： 具有真核表达调控元件（如启动子、增强子、加尾信号等）、真核复制起始信号以及必需的原核载体序列。常用的有酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体。
        • 酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体
  • 基本步骤
    • ①目的基因的获取(分)
      • 化学合成；PCR或RT-PCR
      • 筛选基因组文库，筛选cDNA文库
    • ②目的基因与载体的切割(切)
      • 相同内切酶；互补黏性末端
    • ③目的基因与载体连接(接)
      • 连接酶；黏性末端连接
    • ④重组DNA导入宿主细胞(转)
      • 转化；转染
    • ⑤重组体的筛选(筛)
      • 遗传标志筛选
        • 抗药性标志选择；标志补救；插入失活/插入表达
      • 序列特异性筛选
        • 酶切法；PCR；核酸杂交；DNA测序
      • 亲和筛选(抗体)
  • 基因治疗
    • 基因矫正，基因置换，基因增补，基因失活(基因沉默)
• 分子生物技术
  • 蛋白质的分离纯化
    • ♦电泳：两性解离，带电→蛋白质的电泳速度不等 ♦凝胶过滤层析：分子大小不一→大分子先洗脱，小分子最后流出 ♦离子交换层析：表面电荷不等→带电不同，与介质的结合程度不同 ♦离心：分子量不同→颗粒密度不同，所受离心力不同 ♦透析（超滤）：分子大小不同→小分子物质扩散（或加压后）漏出透析袋 ♦丙酮沉淀，盐析作用：水化膜，表面电荷→破坏表面电荷和水化膜，使蛋白质沉淀
    • 电泳的速度取决于
      • ①带电情况(蛋白质所在溶液的PH值/离子强度) ②分子大小， ③分子形状
    • 凝胶过滤层析(分子筛层析)
      • 凝胶过滤层析（分子筛层析） 在层析柱中事先加入表面带孔的葡聚糖颗粒，当蛋白质混合物通过时，小分子蛋白能够进入葡聚糖颗粒内部，需要较长时间才能流出。而大分子蛋白不能进入葡聚糖颗粒内部，很快通过层析柱流出。
      • 分子越大流出越快，分子越小流出越慢
  • 分子杂交与印迹技术
    • DNA印迹： Southern blotting
    • RNA印迹： Northern blotting
    • 蛋白质印迹(免疫印迹)： Western blotting
    • ♦原理：DNA的变性与复性 ♦探针：标记的已知序列单链核酸分子 ♦流程：提取→电泳→转膜→杂交→检测
  • PCR技术
    • PCR即聚合酶链反应， 实质是在试管中模拟DNA的复制过程，可以使少量的目的基因在短时间内得到大量扩增。
    • 反应体系
      • DNA模板：需为单链
      • 特异性DNA引物
        • 特异性DNA引物：为DNA聚合酶提供羟基末端，是体外合成的一对小片段DNA，但必需与欲扩增目的基因的碱基序列相互
      • dNTP：复制的底物
      • 耐热DNA聚合酶
        • 耐热DNA聚合酶：由于缺乏细胞内复制所需的一系列酶，在试管中要借助高温使DNA双链解开，因此必需是耐热的DNA聚合酶，最常用Taq DNA聚合酶。
      • Mg²⁺缓冲液
      • ①变性(95℃); ②退火：比引物Tm低5℃; ③延伸：72℃ ♦RT-PCR(逆转录PCR)：检测mRNA水平
    • 应用
      • 目的基因的克隆，基因的体外突变，DNA序列测定， DNA和RNA的微量分析，基因突变分析
  • 生物大分子相互作用研究技术
    • 蛋白-蛋白相互作用
      • 酵母双杂交；标签蛋白沉淀
    • DNA-蛋白相互作用
      • 电泳迁移率变动；染色质免疫沉淀
  • 生物芯片技术(高通量、大规模检测)
    • 基因芯片
      • 实质：核酸分子杂交
      • 进行基因差异表达分析
    • 蛋白质芯片
  • 遗传修饰动物模型
    • 转基因技术：基因过表达模型
    • 基因敲除动物：基因失活