来世不读医-细胞学绪论

细胞学绪论知识点总结，包括组织学的研究内容和意义，组织学发展简史。组织学的研究方法和技术。小伙伴们赶快学习起来吧！

细胞学绪论

• 组织学的研究内容和意义
  • 组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学
    • 微细结构是指显微镜下才能清楚观察的结构
  • 组织
    • 细胞
    • 细胞外基质
      • 由细胞产生，构成细胞生成的微环境，对细胞起支持营养保护和联系等作用，对细胞的增殖，分化，迁移和信息传递等行为也有重要影响
      • 结构和功能取决于其中生物大分子
    • 组织分为
      • 上皮
      • 结缔
      • 肌
      • 神经
  • 器官
    • 这些组织按一定的方式有机地组成器官
    • • 空腔性器官
        • 心，胃，膀胱，子宫
      • 实质性器官
        • 肝，脾，肺，肾
  • 系统
• 组织学发展简史
  • 显微镜的发生和细胞的发现
    • 放大镜（16世纪荷兰的眼镜工匠）
    • 第一台显微镜（1590荷兰光学匠师Janssen）
    • 改进显微镜效率黄蓉照明方法，创造cell（Hooke）
    • 显微镜制造者和观察者，证明了毛细血管连接着动脉和静脉（Leeuwenhock）
    • 动物和植物材料显微镜观察技术创始人之一，最先使用染色剂和水银，石蜡制作标本（Malpighi）
  • 显微镜的改进和细胞学说
    • 可消色差的反射显微镜，并制成水浸物镜（Amici）
    • 消色差的物镜和油浸显微镜，发明聚光器（Abbe)
    • 设计和制作切片机（Welker)
    • 细胞学说（Schleiden和Schwann)
    • 否认细胞自由形成，细胞产生于细胞，建立了细胞病理学（Wirchow)
    • 创立使用了染色体，染色质，有丝分裂等朮语，提供动物和植物细胞是存在的细胞均等分裂而来，细胞核分裂先与细胞体分裂（Elemming和Strasburger）
  • 组织概念的提出和组织学的建立
    • 提出组织学说(Bichat)
    • 组织归纳为8种，创用histology(Mayer)
    • 组织由细胞和细胞产物构成，根据细胞的发育程度把组织分成5类，并发现了周围神经的神经元细胞（Schwann）
    • 观察了神经细胞及突起，有髓神经纤维以及小脑的梨状神经元，并描述了各种动物的上皮组织和纤毛活动（Purkinje)
    • 对各种腺体，软骨和骨，结缔组织等进行研究
    • 银染技术，系统研究了中枢神经系统的神经元，神经胶质细胞，大脑皮质和小脑皮质的细胞构筑以及神经通路（Golgi和Cajal）
  • 现代组织学发展
    • 透射电镜（Knoll和Ruska）
    • 超薄切片机，标本制备技术的改进，扫描电镜的发明
    • 神经元通过突触相互连接，纤毛摆动的微管滑动学说，肌纤维收缩的肌丝滑动学说
    • 新方法
      • DNA的Feulgen
      • 多糖的过碘酸-Schiff
    • 免疫组织化学
      • 荧光素标记和直接法
      • 酶标记和间接法
      • 酶抗酶复合物法PAP
      • 亲和素-生物素-酶复合物法ABC
    • 生物物理学
      • 放射自显影技术
      • X射线显微分析朮
      • X射线衍射朮
      • 显微分光朮
      • 图像分析朮
      • 流式细胞朮
      • 激光扫描共聚显微朮
• 组织学的研究方法和技术
  • 光学显微镜朮
    • 光学纤维镜朮的制备方法
      • 固定
        • 取动物或人体的新鲜组织块，用一定的化学试剂处理，使组织内的蛋白质迅速凝固或沉淀，以防止酶引起的细胞自溶和细菌引起的组织腐烂
        • 固定剂
          • 甲醛，戊二醛，苦味酸，醋酸，酒精，丙酮，四氧化锇
        • 固定时一般将组织块浸泡在固定液，或经血管或心脏灌注固定液，使固定更加均匀迅速效果更好
      • 切片
        • 石蜡切片（常规）
          • 脱水和透明（酒精和二甲苯）
          • 融化石蜡浸透包埋
            • 制作较大组织块（如脑，眼球）可用火棉胶包埋
          • 组织切片（5～10um）
        • 冷冻切片
          • 组织块快速冷冻，变硬，用恒冷箱切片机
          • 保存酶的活性和脂类物质
        • 振动切片机
          • 防止石蜡切片的高温处理和冷冻切片的冰晶形成，常用于神经组织
        • 涂片
          • 血液，体液，培养细胞等直接涂在玻片上制成涂片
        • 铺片
          • 疏松结缔组织或肠系膜等撕成薄片，铺在载玻片上制成铺片
        • 磨片
          • 骨和牙等硬组织磨成薄片
      • 染色
        • 染料
          • 碱性染料
            • 碱性助色基团
            • 在溶液中带正电荷
            • 苏木精，甲苯胺蓝，碱性品红
          • 酸性染料
            • 酸性助色基团
            • 在溶液中带负电荷
            • 伊红，橙黄G，亮绿
        • HE染色法
        • • 嗜碱性
          • 嗜酸性
          • 中性
        • 染色后的切片经脱水，透明，用树胶和盖玻片封固，即可在光镜下观察，并长期保存
        • 异染性
          • 甲苯胺蓝，紫红色
          • 染料单体时呈蓝色，而与含大量阴离子物质耦合聚合成多聚体，后者呈紫红色
        • • 亲银性
            • 直接还原阴离子为银颗粒而呈现黑色
          • 嗜银性
    • 普通光学显微镜
      • 分辨率
        • 可分辨出两点间的最小距离
        • 与光线的波长呈现正比，与物镜的数值孔径NA成反比
          • 普通物镜光线通过的介质是空气，NA小于1
          • 如使用油浸物浸，在镜头与标本间加香柏油，NA可达1.4
    • 荧光显微镜
      • • 光源
          • 高压汞灯或金属卤化灯
          • 用以产生波长短，能量高的紫外光或蓝紫光
        • 滤片系统
          • 激发滤片
          • 阻断滤片
          • 吸热滤片
          • 吸收紫外线滤片
        • 显微镜
      • 用于观察组织，细胞中游自发荧光，诱发荧光或经荧光染料染色或标记的结构
      • 以紫外线或蓝紫光激发标本的荧光物质，使之产生各种不同颜色的荧光，通过观察荧光的分布与强弱来测定被检物质
        • 神经细胞脂褐素呈黄色自发荧光
        • 儿茶酚胺在甲醛诱发下呈现黄绿色荧光
        • 吖啶橙可与DNA和RNA结合，使DNA黄绿色荧光，RNA橙红色荧光
      • 全内反射荧光显微镜
        • 光线在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下
        • 大大降低了背景光噪声对观测目标的干扰
        • 生命活动过程
          • 如信号转导，蛋白质转运，肌球蛋白运动，ATP酶翻转，胞吞和胞吐以及病原体入侵等亚细胞甚至分子级别的事件，尤其适于观察细胞表面物质的动态
    • 暗视野显微镜
      • 反差太小或小于普通显微镜分辨力的微小颗粒
        • 细胞内线粒体及标本中细菌等微粒的运动
        • 放射自显影标本的银粒
        • 免疫金染色的金粒
      • 0.004～0.2um分辨率
    • 相差显微镜
      • 用于观察细胞培养中活细胞的形态结构及生长变化情况
      • 光通过细胞内具有不同厚度或折射率的结构时，速度和方向发生改变，产生光程差，光程差使两束光的波峰和波谷位置不再并列，即发生了相位差，在物镜后焦面处装有相位板，可将这种相位差转变为振动差（明暗差），这样就使活细胞的不同结构出现显著的明暗反差，并具有立体感
      • 倒置显微镜
        • 观察贴附于瓶底的活细胞进行某些显微操作
        • 光源和聚光器安装在载物台上方，将物镜安装在载物台下方
    • 偏振光显微镜
      • 微细结构
        • 肌纤维，肌原纤维，细胞膜和纺锤体等研究
      • 检偏器和起偏器
      • 正交检偏位观察标本时，如果旋转镜台，视野始终黑暗，则被检物为各向同性（单折射体），如旋转镜台一周，被检物4次饮没，4次明亮，则为各向异性（双折射体）
    • 激光扫描共聚焦显微镜
      • • 激光系统
        • 共聚焦成像扫描系统
        • 光检测器
        • 显微镜
        • 计算机图像分析系统
      • • 激光光源产生一定波长的激光束通过扫描器内照明针孔的光阑作用形成点光源，经由分光镜反射至物镜并聚焦于样品，对样品内焦平面上的每一点进行扫描
        • 样品上对应的被照射点受激发出荧光再被物镜汇聚，经原来入射出荧光再次被物镜汇聚，经原来入射光线直接反向回到分光镜，继而通过检测针孔被检测器接收，再经过光电信号转换在显示屏上
      • 检测针孔和照明针孔的位置相对于物镜的焦平面是共轭的
      • 分析率，清晰度和对比度高
        • 某一瞬间只有焦平面上被扫描点的荧光能穿过检测针孔而被检测成像，焦平面上每一个的荧光图像共同组成一副完整的二维共聚焦图像，而非焦平面上样品的散射光则被阻挡在检测针孔之外而不能成像
      • • 突破了普通光镜不能对细胞或组织内部进行定位检测的限制
        • 实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，可进行一系列亚细胞水平结构和功能研究，如定位，定性，定量分析细胞内核酸，蛋白质表达，测定细胞内钙离子溶度，ph值，膜电位，细胞通讯，膜流动性，观察细胞内物质运输和蛋白质的相互作用，还可对细胞进行切割，分离和筛选
      • 光漂白，光毒性（激光照射使荧光染料分子产生单态氧或自由基等细胞毒素）及厚样品穿透力差等局限性
        • 采用双光子或多光子LSCM结合双光子和多光子激发技术
    • 超分辨率显微镜
      • 受激发射损耗STED
        • 用一束激发光使荧光物质激活的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨的波长较长的环形激光将第一束光斑中大部分荧光物质通过受激光发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，将显微镜的分辨率提高到30nm
      • 光活化定位显微技术PALM
        • 后两个技术利用光控开关荧光分子技术，通过激发光活化荧光分子发光，在同一区域进行多次成像，每次仅让很少量的分散分子发光，然后将这些图像叠加起来产生密集的纳米尺寸超分辨率图像，定位精度达到10nm
      • 随机光学重构显微朮STORM
  • 电子显微镜朮
    • 电子束代替可见光，电磁场代替玻璃透镜
      • 透射显微镜朮（TEM）
        • 分辨率0.1～0.2nm
        • 50~80nm超薄切片
          • 双醛固定液（多聚甲醛和戊二醛）和四氧化锇先后进行固定
          • 树脂包埋
          • 超薄切片机
          • 重金属盐染色（柠檬酸铅和醋酸铀)
        • • 电子密度高
            • 电子束散射较多，射落到荧光屏上的电子少，屏幕暗
          • 电子密度低
        • 超高压电镜HVEM
          • 电子穿透力增强，可穿透0.5～6um厚度切片，用以观察细胞骨架，各种细胞器的立体超微结构及其相互关系
      • 扫描电镜朮SEM
        • 用于观察细胞，组织和器官表面的立体微细结构
        • 固定，脱水和临界点干燥后，在其表面喷镀薄层碳膜和金属膜。
        • 扫射电镜发射的细电子束在样品表面按顺序逐点移动扫描，使样品表面金属膜发出二次电子
      • 冷冻蚀刻术和冷冻隔断朮
        • 冷冻蚀刻朮
          • 细胞断裂表面的微细结构，特别是质膜的结构
          • 为了防止冰晶的形成和提高冷冻速度，先将固定或未固定的组织块用甘油生理盐水处理，然后投入液氮中快速冷冻，在低温下用钢刀将组织劈开，使之形成横裂面，并在低温真空条件下使断裂面的水分升华，再喷镀一层白金膜和碳膜，用强酸将组织溶蚀掉，剩下的金属复型膜可贴附于载网，用透射电镜观察
        • 冷冻切割术
          • 将固定组织二次包埋后，浸于二甲亚砜中，在低温隔断，隔断面喷镀合金，在扫描电镜下观察组织断裂面的立体结构
          • 内部微细结构的相互关系
            • 肝细胞与胆小管
            • 肾小囊与血管球
      • X射线显微分析朮
        • 利用高速电子束轰击电镜内生物标本的微小区域，使该区域所含的不同元素发射出一定波长的X射线
  • 原子力显微镜朮
    • 将一个非常尖锐的探针（一个原子大小）安装在悬臂末端下面，有一束激光聚焦在悬臂末端的上表面，当探针在样品上扫描时，由于样品表面的原子与探针尖端的原子间相互作用力，悬臂将随起伏不平的样品表面而上下移动，悬臂的微小位移变化由激光束反射到由光二极管构成的光检测器，被接受放大，并转换为电流，再经计算机处理为样品表面结构图像
    • 样品下面有一个压电扫描器，与光检测器形成敏感的反馈回路，当探针上下移动时，压电扫描器通过上下移动样品使激光束能够准确反射到光检测器，并使针尖与样品表面维持恒定的作用力
    • • 接触式
      • 轻敲式
    • 生物样品不需特殊处理，可在空气和液体介质直接观察
  • 放射自显影朮
    • 研究机体对放射性核素的摄入和代谢过程
    • 制成切片或薄片，并在上涂以薄层核乳胶，置暗处曝光或取材后制成超薄切片，涂核乳胶曝光
    • 放射性核素产生的射线使胶片和乳胶感光，银离子被还原为银颗粒
  • 组织化学和细胞化学技术
    • 糖类
      • 过碘酸-Schiff反应PAS反应
        • 过碘酸是一种强氧化剂，可将糖分子的乙二醇基氧化层乙二醛基
        • 再和Schiff（无色亚硫酸品红F(SO2H）结合，形成不溶性紫红色物质
      • 酸性糖蛋白用阿辛蓝染色
    • 脂类
      • 甲醛固定，冷冻切片
      • 苏丹III，苏丹IV，苏丹黑，油红O，尼罗蓝
      • 四氧化锇固定兼染色，脂肪酸或胆碱可使四氧化锇还原呈二氧化锇而呈现黑色
    • 核酸
      • 福尔根反应
        • 用稀盐酸处理切片，使DNA水解，打开脱氧核糖与嘌呤碱基之间的连接键，形成醛基，再与Schiff试剂作用，形成紫红色反应产物
          • 甲基绿与细胞核DNA结合呈现蓝绿色
          • 派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色
    • 酶类
      • 捕获反应产物
  • 免疫组织化学技术和免疫细胞化学技术
    • 特异性强，敏感度高
    • • 单克隆抗体
      • 抗体标记荧光染料
        • 异硫氰酸荧光素
        • 四甲基异硫氰酸罗丹明
        • 德克萨斯红
        • 羰化青
      • 酶类
        • 辣根过氧化物酶
        • 碱性磷酸酶
      • 金属
        • 胶体金
        • 铁蛋白
    • • 直接法
        • 敏感性较差
      • 间接法
        • 第二抗体
      • 过氧化物酶抗过氧化物酶发PAP
        • 制备过氧化物酶的抗体与适量过氧化物酶混合，制成可溶性的PAP复合物，后者含2个抗酶抗体分子和3个酶分子形成稳定五环结构
        • 以双氧水和二氨基联苯胺DAB为底物显示过氧化物酶
      • 亲和素-生物素-过氧化物酶复合法ABC法
        • 生物素为含硫的杂环单羧酸，分子量小，通过其羧基与蛋白质的氨基结合，从而可标记抗体和酶
        • 亲和素是一种糖蛋白，又称抗生物素蛋白，与生物素有较高的亲和力，1个亲和素分子上有4个生物素接触位点，亲和素还可被荧光素，酶，胶体金标记
      • 链霉亲和素生物素过氧化物酶法
    • 双重染色或多重染色
      • 多采用间接荧光法
    • 免疫电镜朮
      • 常用胶体金作标记物
        • 胶体金颗粒呈现圆形，电子密度高，表面粗糙，带有负电荷，蛋白质通过静电吸引吸附于胶体金表面
      • 光学电子关联电镜朮CLEM，明显提高了免疫电镜朮的效率
  • 凝聚素细胞化学技术
    • 鉴定和定位细胞表面的糖链或寡糖（不能PAS）
    • 凝聚素主要来源于植物种子的糖蛋白或蛋白质，不同的凝聚素可以与不同的糖链特异性结合
    • 标记凝聚素或未标记的凝聚素加于组织切片，使之与特异性糖链结合
  • 原味杂交技术
    • 组织细胞原味进行的核酸分子杂交技术，敏感度高，特异性强
    • 原理是两条单核甘酸链碱基互补配对形成稳定杂合体
    • 探针
      • cDNA探针
      • cRNA探针
      • 寡核苷酸探针
        • 分子小，大小易于控制，组织穿透性好，杂交效率高
    • 标记物
      • 放射性
      • 非放射性
        • 生物素，地高辛精，碱基磷酸酶，FITC
    • 单拷贝或低拷贝DNA和mRNA不易检出
      • 原位PCR
      • 反转录PCR
  • 活体组织和活细胞研究方法
    • 细胞培养朮与组织工程
      • 细胞培养
        • 大多利用机械分散法或酶（如胰酶和胶原酶）消化法分离组织中的某种细胞，并进行纯化，使其成为单细胞悬液，然后接种于培养瓶或培养板，使之贴壁生长或悬浮生长
        • 二氧化碳培养箱，无菌，防止微生物污染，合适温度，氧气和二氧化碳浓度，湿度，35～37℃，95%空气和5%CO2的混合气体，相对湿度大于98%
      • 培养基
        • 常加入不同溶度的血清
        • 干细胞扩增，培养细胞同步化，可用无血清培养液
      • • 原代培养
        • 传代培养
          • 细胞系（传代培养而成的细胞群体）
          • 细胞株（细胞克隆或单细胞培养而成的纯种细胞）
    • 活体染色与活细胞染色
      • • 墨汁与巨噬细胞
        • 血液与煌焦油蓝染液（体外）
      • • 台酚蓝
        • Hoechst33258(可进入活细胞和凋亡细胞，使细胞核呈蓝色荧光，活细胞的荧光均匀，凋亡细胞荧光不均匀，增强或边聚)和碘化丙啶（死细胞，核呈现红色）
    • 细胞分离术
      • 利用细胞黏附性，大小，密度和特殊的表面标志
      • 除血液，胸腔积液和腹腔积液外，分离细胞时要先将组织匀浆，制成细胞悬液
      • • 差速离心法
          • 细胞组分分离
        • 密度梯度离心
          • 分离介质
            • 聚蔗糖Ficoll和聚维酮包裹的胶粒颗粒Percoll
          • Ficoll与三碘化合物泛影葡胺组成的分离液可将人血液中单核细胞与粒细胞和红细胞分开，是分离淋巴细胞的常规试剂
          • Percoll在高速离心下，形成由上而下递增的连续梯度密度
        • 流式细胞仪和免疫微球法
    • 组织芯片技术
    • 形态学研究的定量朮
      • 形态计量朮
        • 组织和细胞进行二维和三维（体视学）的形态学测量研究
      • 显微分光光度朮
        • 对组织和细胞内化学成分进行定量检测技术
      • 图像分析朮
      • 流式细胞朮
        • 对流动的单个细胞或颗粒进行鉴定分类计数和分选纯化
        • 分离被检细胞，制成单细胞悬液，并进行荧光染色或标记，使单细胞悬液快速通过该仪器的激光照射分析区，被检细胞产生不同的荧光信号转变为电脉冲，分别输入计算机贮存