免疫组化（IHC）与病理诊断

在常规肿瘤病理诊断中，约有10%左右的病例单靠基本的HE染色难以做出明确的诊断。在此时，为使得诊断准确，需要免疫组化的帮忙，尤其是在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达75%。因此，不是所有病人都需要做免疫组化检查，但是病理科医生在面临诊断不明确的时候，就会要求病人来做免疫组化，协助检查。

免疫组化（IHC）与病理诊断

• 免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)是临床病理诊断中常用的技术和手段。从20世纪70年代开始，免疫组化技术就已经应用于病理诊断，对诊断肿瘤、肿瘤分类、判断预后产生了巨大的影响，同时也扩展了人们对于各种疾病及肿瘤形成过程的认识，提高了病理诊断与研究水平。本文重点讨论了免疫组化技术在临床上的应用与常见的免疫组化指标在临床上的意义。
• 免疫组化
  • 定义
    • 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原。然后通过免疫动物后获得特异性的抗体，再用此抗体去探测组织或细胞中的同类抗原物质。
    • 由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法（荧光素、酶、金属离子、同位素）将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。
    • The theoretical diagram of IHC
  • 样本
    • 组织
      • 组织是来自患者或动物，经过冷冻或石蜡包埋。将这些组织制成约4μm厚的切片，封片后再处理。
    • 细胞
      • 若样本是细胞，通常被称为免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）。对于ICC，大部分细胞外基质及其他基质组分被去除，只剩下整个细胞来染色。ICC的来源可以是细胞悬液，来自患者或动物（如血涂片、拭子等），或在实验室中进行的组织培养细胞系。
  • 特点
    • 免疫组化，就是病理诊断中最常用的检测技术。
  • 临床应用
    • 肿瘤良恶性的判断：对于反应性增生还是肿瘤性增生，可用免疫球蛋白(Ig)的轻链抗体检测B淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别。
    • 确定肿瘤分期：肿瘤分期是判断预后的一个指标，与是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭密切相关，而通过免疫组化方法可以判断肿瘤是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭。
    • 细胞属性的判定：通过特定抗体标记出细胞内相应的抗原成分，来判定细胞的属性，确定肿瘤的来源。
    • 确定来源不明的转移瘤的原发部位：对于来源不明的转移瘤，用免疫组化技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源，进一步确定原发部位。如角蛋白抗体(CK20)在胃肠道癌、胆管癌、胰腺癌中阳性，而在肺癌、乳腺癌、肾癌中阴性。
    • 对“未分化”恶性肿瘤的分类：未分化恶性肿瘤包括癌或肉瘤，在HE切片上由于肿瘤的“未分化”而缺少肿瘤细胞的起源特征不能分类，初步区分组织学类型用非特异性抗体，在其基础上再选用特异性抗体做进一步鉴定。
    • 进一步分类不同器官与组织交界处肿瘤：由于重叠的特征，在一些组织器官交界处的肿瘤，仅凭组织学基础对肿瘤进行分类很困难。如发生于组织交界处的肿瘤有睾丸胚胎癌与精原细胞癌，两者较难区别，且治疗与预后显著不同，但用免疫组化检测角蛋白就较易于区别：角蛋白阴性则为精原细胞癌，而角蛋白阳性则为胚胎癌。
    • 及时准确的发现微小转移灶：在常规组织切片中，辨别单个或几个转移性肿瘤细胞很难，淋巴结内窦性组织细胞增生与某些癌的早期转移有时也不易区别，而采用免疫组化方法，有助于及时准确的发现微小(癌)转移灶。
• 病理诊断
  • 定义
    • 病理诊断是研究疾病发生发展和疾病过程中患病机体形态结构、功能代谢改变与疾病转归，从而为疾病的诊断、治疗与预防提供必要的理论基础和实践依据。
  • 样本
    • 病理诊断是对手术切下或尸体解剖取下的肿瘤标本进行固定染色后，在显微镜下进行组织学检查，以便于诊断疾病，样本更多源于患者。尽管各种影像学技术飞速发展，但是病理诊断仍然是肿瘤各种检查方法中最可靠的，病理诊断被喻为“金标准”，也是疾病的最终诊断。
  • 特点
    • 病理诊断获得实际证据，因其通过显微镜观察疑似病变组织的细胞形态和结构，可直接看出组织发生了怎样的病理变化，能较准确地对疾病做出判断，尤其在肿瘤性质的诊断上更为常用。
  • 病理诊断中免疫组化的局限性
    • 但是，随着免疫组化的广泛应用，发现免疫组化技术存在一些局限性。在肿瘤诊断中评估免疫组化的局限性主要在抗体特异性和解释方面。在免疫组化操作过程中中都必须有适当的阳性与阴性对照，作为技术完整性质量控制，如对照组被忽略或不理想时，免疫组化染色的结果要谨慎对待，免疫组化的正确结果，不仅要依靠技术步骤上规范化操作，而且有赖于正确的解释，在报告免疫组化染色结果时不应孤立地解释，应考虑到诊断与鉴别诊断、所应用的抗体特性、所研究组织性质，同时还要注意假阳性与假阴性结果的干扰。深入研究免疫组化原理和技术，必须熟悉各种抗体真阳性反应部位，实现实验室间免疫组化标准化，使免疫组化在病理诊断中发挥最大的辅助作用。
• 临床上常用免疫组化指标的意义
  • 恶性肿瘤的 Ki-67 和 p53 常规检查
    • 目前的研究表明，大部肿瘤的复发、转移取决于 Ki-67 值和 p53 值，而与肿瘤的组织的分型关系不是十分密切，如中分化腺癌，如果 Ki-67 和 p53 值超过 50%，预后不佳。相反，如肿瘤的组织分型为低分化腺癌，而 Ki-67 和 p53 值较低，预后也会较中分化或高分化癌的预后稍好。
  • 耐药预后标记全套 4 项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67
    • P-糖蛋白（P-gp）--药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫杉醇及泰素帝。
    • 谷光甘肽 S 转移酶（GST π）--解毒作用--胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺及瘤可宁。
    • 拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）--靶点作用--胞核--阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如 VP-16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对 VP-16 尤其有效。
    • Ki-67--细胞增殖标志--胞核--阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高。
  • 乳腺癌五项（ER、PR、C-erbB-2(Her-2)、Ki-67、p53）
    • 乳腺癌耐药预后标记，全套 7 项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，HER2
    • 雌激素受体（ER）--性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。
    • 孕激素受体（PR）--性激素作用--胞核--阳性率越高，肿瘤对内分泌治疗越有效，预后越好。
    • C-erbB-2--癌基因产物--胞浆--阳性率越高，肿瘤恶性程度越高。
    • p53 一种抑癌基因，分野生型（Wtp53）和突变型（Mtp53）。野生型 Wtp53 因微量免疫组化难以检测，突变型 Mtp53 能够被免疫组化测定，突变后则丧失了启动细胞凋亡的能力。突变型 p53 高表达，细胞的高度增生、分化程度差分化、恶性程度越高、预后不良，公认预后差指标之一。
  • 垂体腺瘤功能六项检查
    • LH（促黄体生成素），FSH（卵泡刺激素），ACTH（促肾上腺皮质激素），TSH（促甲状腺素），PRL（泌乳素）、GH（生长激素）。根据某一种抗体阳性表达进行术后药物治疗。
  • GIST（胃肠道间质瘤）诊断
    • GIST 特征性表达 CD117（95%）
    • GIST 特征性表达 DOG1，DOG1 阳性表达部位与 CD117 相似
    • DOG1 可以表达于部分 CD117 阴性的 GIST 中（6%）
    • DOG1 在胃部 GIST、上皮样 GIST、PDGFRA 突变的病例中，表达率高
    • 大多数表达 CD34（70%）、局灶性表达 SMA（40%）、S-100 蛋白（5%）、通常不表达 desmin（2%）。
    • 标准免疫组化染色套餐是：CD117、DOG1、CD34、SMA、S-100和Desmin。可依据组织形态表现，添加需要的鉴别染色抗体。
  • 淋巴瘤的 WHO 分型
    • 淋巴瘤 WHO 最新分型有 33 个亚型，每个亚型的预后和治疗方案均有所不同，而淋巴瘤的诊断和分型又是极其困难的，是病理中的难中之难，所以诊断淋巴瘤的免疫组化方案必须「双份套餐式」的，即每一种组织的标记物必须用 2 种以上的抗体。
    • 诊断 B 细胞淋巴瘤，必须有 CD20 和 CD79a 阳性正面证实，同时还需要用 CD3 阴性反面来证实，因此诊断淋巴瘤需 8-10 种左右的抗体，才能准确地反应出淋巴瘤各种亚型的信息。
• 实验问题总结与处理方案
  • 边缘效应
    • 组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织。
    • 切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。
  • 产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？如何解决？
    • 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
    • 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
    • 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。
    • 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。
    • DAB孵育时间过长或浓度过高。
    • PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要。
    • 标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
  • 免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些？
    • 抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须摸索最佳浓度。
    • 抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复。
    • 组织切片本身这种抗原含量低。
    • 血清封闭时间过长。
    • DAB孵育时间过短。
    • 细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。
    • 开始做免疫组化，一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
  • 背景强的原因？
    • 考虑一抗浓度高。
    • 然后调整DAB孵育时间。
    • 也要考虑血清封闭时间是否过短。
    • 适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。
  • 石蜡切片在染色过程中出现脱片现象？
    • 烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度。
    • 用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做。
    • 有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织。
    • 用高温修复时，温度骤冷也可能引起。
  • 一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？
    • 一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片。
    • 另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
  • 切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？
    • 全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
    • 体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。
    • 抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
    • DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
    • 组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。
    • 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4?C冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。
    • 一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
  • 脱片产生的原因有哪些？
    • 多聚赖氨酸玻片质量的问题。
    • 组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。
    • 没烤好，时间短，温度不够之类。
    • 操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
    • 修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。
    • 一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。
    • 组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
  • DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？
    • 切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。
    • 有可能是你显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。
    • 如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。
  • 染色过强
    • 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）。
    • 孵育温度过高。
    • DAB显色时间过长或DAB浓度过高，显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准。
  • 非特异性背景染色
    • 操作过程中冲洗不充分。
    • 组织中含过氧化物酶未阻断，可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长。
    • 组织中含内源性生物素，可用正常非免疫动物血清再封闭。
    • 血清蛋白封闭不充分，可延长血清蛋白封闭时间。
  • 染色弱
    • 抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟。
    • 试剂超过有效使用期及时更换试剂。
    • 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释，可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）。
    • 室温太低，低于15℃若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）。
    • 蛋白封闭过度，封闭时间不要超过10分钟。
  • 染色阴性
    • 操作步骤错误重新试验，设立阳性对照。
    • 组织中无抗原设立阳性对照片，以验证实验结果。
    • 一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗与二抗种属无误。